新型神經(jīng)導管復合材料與骨髓間充質干細胞用于周圍神經(jīng)缺損的基礎研究.pdf

1、一、研究背景:
　　 周圍神經(jīng)缺損的修復與重建是目前世界性的難題，臨床治療的金標準是自體神經(jīng)移植，但存在供體來源有限、供區(qū)感覺及運動功能受損等弊端，因此探索周圍神經(jīng)損傷修復的新方法具有重要意義。組織工程學研究為解決這一問題提供了新思路。種子細胞和導管支架制成的復合體是構建組織工程的核心。目前，組織工程中應用較多的種子細胞有:雪旺細胞、骨髓間充質干細胞、骨骼肌干細胞、神經(jīng)干細胞以及胚胎干細胞等。骨髓間充質干細胞(mesenchym

2、al stemcells，MSCs)是細胞治療中常用的一種，具有自我更新和多向分化的潛能，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠在體外穩(wěn)定的生存和繁殖，并能保持多向分化能力，是體外操作的理想細胞。骨髓間充質干細胞誘導分化為雪旺細胞和神經(jīng)元樣細胞能分泌神經(jīng)生長因子，對神經(jīng)修復有促進作用。另外，骨髓間充質干細胞取材容易，且能在體外迅速增殖和誘導分化，移植后可以在免疫豁免區(qū)存活，避免了免疫排斥反應，因而用于周圍神經(jīng)損傷的修復治療研究，具有廣闊的應用前景。<

3、br>　　 目前導管材料主要包括:生物型神經(jīng)導管、人工合成導管、復合組織導管。導管材料作為人工細胞外基質為細胞提供賴以粘附、生長、分化、和增殖的場所，有利進行正常新陳代謝。許多研究表明，神經(jīng)再生過程中，斷端的神經(jīng)再生和神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子等的作用關系密切，當神經(jīng)缺損超過一定距離后，營養(yǎng)物質供應缺乏，導致遠端和近端不能重新連接。前期課題組自行設計并合成了精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β

4、-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子緩釋導管，并用于修復大鼠10mm坐骨神經(jīng)缺損，結果表明該導管對大鼠坐骨神經(jīng)缺損具有良好的橋梁作用和促進神經(jīng)生長的作用，而且動物實驗證明該新型神經(jīng)導管復合材料沒有細胞毒性。
　　 本實驗通過定向誘導骨髓間充質干細胞分化為神經(jīng)樣細胞，鑒定其特異性標志物的表達，并將其作為種子細胞加入神經(jīng)導管中，制成新型導管復合材料。
　　 二、研究目的
　　 1、前期課題組從仿生設計的角度出發(fā)，以神經(jīng)基底膜結構

5、與組成的分析研究為基礎，將生物可吸收PDLLA作為基本骨架材料，添加能夠促進神經(jīng)生長的PRGD成分及能誘導神經(jīng)生長的NGF，添加能調整置入?yún)^(qū)PH值的β-TCP成分，成功構建出PRGD/PDLLA/NGF/β-TCP新型神經(jīng)導管復合材料，目的旨在通過體外細胞實驗評價其細胞親和性和緩釋性能。
　　 2、在體外條件下分離、提純鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)并傳代培養(yǎng)

6、，加入堿性成纖維細胞生長因子(Basicfibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)對第三代BMSCs進行誘導，觀察細胞形態(tài)變化，并用免疫組織化學方法檢測誘導分化后的神經(jīng)樣細胞標志物;分化為神經(jīng)樣細胞，目的旨在通過細胞試驗評價骨髓間充質干那細胞誘導分化為神經(jīng)樣細胞的可行性。作為周圍神經(jīng)損傷修復的基礎研究;
　　 3、在驗證新型神經(jīng)導管具有良好

7、的細胞親和性和緩釋性能以及堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)能誘導骨髓間充質干細胞分化為神經(jīng)樣細胞的基礎上，將新型神經(jīng)導管復合材料和骨髓間充質干細胞制成復合體，通過體外細胞生物學評價二者的生物相容性和評估其用于修復大動物長段周圍神經(jīng)缺損的可能性，為下一階段動物實驗研究和臨床應用奠定理論基礎。
　　

8、 三、實驗方法
　　 1、新型神經(jīng)導管復合材料的設計與制備
　　 從仿生設計的角度考慮，首先以神經(jīng)基底膜結構與組成的分析研究為基礎，自行設計并合成了RGD多肽接枝的高分子聚(羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸)(PRGD)，以乙酸乙酯為溶劑，分別加入濃度為85％、相對分子質量為10×104～25×104的聚乳酸(PDLLA)，濃度為10％的PRGD，濃度為5％、平均粒徑小于500nm的β-磷酸三鈣(β-TCP)以及微量神經(jīng)生長因

9、子(NGF)，經(jīng)超聲波分散，磁力攪拌，采用溶劑揮發(fā)法制備PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF復合成膜。
　　 2、鼠骨髓間充質干細胞的分離、純化及傳代
　　 SD大鼠10％水合氯醛腹腔注射，麻醉后體積分數(shù)75％乙醇浸泡30min，置于超凈工作臺上，嚴格無菌操作下取大鼠雙側股骨和脛骨，將骨骺端剪去，暴露兩端骨髓腔，用5ml注射器抽取DMEM液反復沖洗骨髓腔，至骨皮質發(fā)白，收集沖洗液于無菌離心管中，1000r/min離心

10、10min，棄去上清液，重懸，計數(shù)，調整細胞密度107L-1接種于培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100g/L)，置于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育。24h后換液并去除未貼壁的細胞，后每3天換液一次，至細胞基本鋪滿瓶底用0.25％胰酶消化，按1∶2比例傳代，進行擴增、純化培養(yǎng)。每日用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況。
　　 3、BMSCs誘導分化及鑒定
　　 3.1BMSC

11、s的增殖和誘導分化;
　　 將生長狀態(tài)良好的第3代細胞用0.25％胰酶消化，收集細胞并調整密度1×105L-1接種于24孔培養(yǎng)板內，分為誘導組和對照組，各設6個復孔，置于37℃，5％ CO2飽和濕度下孵育。24h后棄培養(yǎng)基，誘導組加入誘導劑（含20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF的DMEM培養(yǎng)液）培養(yǎng)，對照則繼續(xù)用含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)，每3天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)7天，每日用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化及生長情況。

12、
　　 3.2細胞免疫組織化學鑒定
　　 誘導7天后，取出培養(yǎng)板做免疫組織化學鑒定，一抗分別為兔抗鼠NSE和β-Tubulin和兔抗鼠 GFAP;二抗為異硫氰酸熒光素(fluorescein5(6)-isothiocyanate，F(xiàn)ITC)。步驟為:吸棄培養(yǎng)液，4％多聚甲醛固定10min;0.3％Triton-X100透膜10min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffersaline，PBS)沖洗3次，山羊血清封

13、閉20min，滴加一抗(1∶200)4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗(1∶100)37℃孵育30min，隨機選擇10個視野，觀察誘導細胞染色陽性的細胞數(shù)。主要觀察指標:①骨髓間充質干細胞的形態(tài)特性;②骨髓間充質干細胞向神經(jīng)細胞分化過程中的形態(tài)變化;③NSE、β-Tubulin、GFAP的表達情況。
　　 4、新型神經(jīng)導管復合材料浸提液的制備
　　 稱取滅菌過的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨

14、酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子復合材料100 mg裝入15 mL離心管，然后加入3 mL細胞培養(yǎng)液。將離心管置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱(100r/min)，24 h后取出浸提液，按1∶9稀釋比例加入α-MEM培養(yǎng)液內混勻，浸提液制備過程確保無菌。
　　 5、新型神經(jīng)導管復合材料與BMSCs相容性研究
　　 5.1MTT法檢測骨髓間充質干細胞活性
　　 將生長良好的第3代骨髓間充質干細胞以5×104m

15、l-1密度接種于96孔培養(yǎng)板，分實驗組、對照組和空白組（只加培養(yǎng)液，不含細胞，用于調零），實驗組加精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子復合膜浸提液0.2 mL，對照組加含體積分數(shù)10％胎牛血清的培養(yǎng)液0.2mL，置于37℃，體積分數(shù)5％CO2飽和濕度下孵育。隔天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)7d。分別取培養(yǎng)1，3，5，7d細胞進行MTT法檢測（詳細步驟參考），在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇5

16、70 nm波長測定吸光度值，記錄實驗數(shù)據(jù)。
　　 5.2流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率
　　 將生長良好的第3代骨髓間充質干細胞接種于6孔培養(yǎng)板，分為實驗組和對照組，實驗組加精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子復合材料浸提液2 mL，對照組加含體積分數(shù)10％胎牛血清的培養(yǎng)液2 mL，37℃，體積分數(shù)5％CO2飽和濕度下孵育

17、。每2d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)7d，分別取培養(yǎng)1，3，5，7 d細胞進行AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率，記錄實驗數(shù)據(jù)和流式散點圖，左上象限(FITC-/PI+)為機械損傷細胞，左下象限(FITC-/PI-)為正常活細胞，右上象限(FITC+/PI+)為晚期凋亡或死亡細胞，右下象限(FITC+/PI-)為早期凋亡細胞。（細胞凋亡率由儀器自動計算）。
　　 5.3掃面電鏡觀察BMSCs
　　 將無菌的精氨酸

18、-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子復合膜剪成12孔培養(yǎng)板孔洞大小，與細胞濃度為1×109 L-1骨髓間充質干細胞共同置于12孔培養(yǎng)板中，37℃、體積分數(shù)5％CO及飽和濕度條件下孵育。將培養(yǎng)7d后的材料取出，PBS沖洗3次，體積分數(shù)2.5％戊二醛4℃固定1h。體積分數(shù)30％，50％，75％，80％，90％，100％叔丁醇脫水，前4級脫水各1次，每次10min，后2級脫水各2次，

19、每次10 min。保留樣本內叔丁醇-20℃冰凍冷藏4h，干燥12 h;噴金，在掃描電鏡下觀察材料表面細胞生長狀況。
　　 6、主要觀察指標
　　 6.1NSE、β-Tubulin、GFAP的表達情況。
　　 6.2 BMSCs在浸提液中生長情況、細胞活力及細胞凋亡率;
　　 7、統(tǒng)計學方法
　　 結果用x±s表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05

20、為差異有顯著性意義。
　　 四、結果
　　 1、成功制備出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神經(jīng)導管，外觀呈乳白色，無嗅，無味。材料表面光滑、無裂紋、無毛刺，質地柔軟，可折彎，易于縫合。體外培養(yǎng)與RSC96細胞具有較好的細胞親和性，并可持續(xù)釋放NGF30天以上。
　　 2、骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)及誘導:原代BMSCs接種24h內開始出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，此時細胞大多數(shù)為圓形。72h后貼壁細胞有偽足伸出，大多數(shù)細胞呈

21、梭形并伴有2～3個突起，細胞核較大，圓扁形，可見1～2個核仁。經(jīng)過三代純化培養(yǎng)后得到的BMSCs形態(tài)為長梭形，形成多個突起并彼此發(fā)生聯(lián)系，完全融合后排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀結構。BMSCs經(jīng)bFGF和EGF誘導24h后，部分細胞增殖呈團簇狀。繼續(xù)培養(yǎng)72h后可見部分細胞發(fā)出兩個或多個突起，胞質回縮，胞體呈多角形或不規(guī)則形，折光性明顯增強。培養(yǎng)7天后可見星狀細胞數(shù)目逐漸增多，細胞突起之間相互連接成網(wǎng)狀，可見細胞核及核仁。
　　

22、3、細胞免疫組織化學鑒定NSE、β-Tubulin、GFAP表達:BMSCs經(jīng)誘導分化7天后，部分有核細胞呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣改變并表達NSE和β-Tubulin陽性，表明其具有神經(jīng)干細胞特性，GFAP染色結果陰性。
　　 4、精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子浸提液對骨髓間充質干細胞活力的影響:實驗采用MTT法檢測實驗組和對照組細胞吸光度值，結果發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)后

23、5，7d，實驗組的吸光度值明顯高于對照組(P＜0.05)。根據(jù)吸光度值描繪的生長曲線發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組和對照組吸光度值逐漸增大，表明細胞活性逐漸增加，實驗組吸光度值明顯大于對照組，即實驗組細胞活性高于對照組。表明精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子浸提液對骨髓間充質干細胞不但無毒性作用，還能增加細胞活性。
　　 5、精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝

24、聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子浸提液對骨髓間充質干細胞凋亡的影響:流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測結果顯示，實驗組（四組都取上午9點時間段測試）細胞凋亡率為(6.43±3.02)％;對照組細胞凋亡率為(16.36±6.88)％，兩組比較差異有顯著性意義(P＜0.05);共培養(yǎng)7d，流式細胞儀檢測結果顯示實驗組右上象限晚期凋亡細胞數(shù)明顯較對照組少，而細胞活性明顯大于對照組。同樣證

25、明精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子浸提液對骨髓間充質干細胞無毒性作用，能延長細胞存活時間，具有良好的細胞相容性。
　　 6、精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子復合材料對骨髓間充質干細胞生長的影響:掃描電鏡觀察見共培養(yǎng)7d，精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳

26、酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子復合材料部分降解，其表面細胞數(shù)較多，細胞生長狀態(tài)良好，體積較大，胞體發(fā)出多個突起，并且細胞之間相互連接交織成網(wǎng)狀，其軸突較長和較粗，呈典型的神經(jīng)元樣細胞表現(xiàn)，見圖6，說明其降解產(chǎn)物無細胞毒性，釋放的神經(jīng)生長因子具有促進骨髓間充質干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的作用，細胞相容性良好。
　　 五、結論
　　 1、通過對天然神經(jīng)基底膜成分的仿生，成功制備出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神經(jīng)導管

27、，體外實驗表明該材料具有良好的生物相容性和細胞親和性，并能持續(xù)釋放NGF達30天。
　　 2、骨髓間充質干細胞具有較強的自我增殖和分化潛能，在適宜的體外條件可誘導分化為神經(jīng)樣細胞，為周圍神經(jīng)損傷修復的研究提供了新思路。
　　 3、試驗充分證明精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子復合材料與骨髓間充質干細胞具有良好的細胞相容性，可作為優(yōu)良的載體用于構建人工仿生