兔動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞黏附分子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及阿托伐他汀干預(yù)后的影響.pdf

1、目的：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是危害人類(lèi)健康的主要疾病之一，對(duì)于A(yíng)S發(fā)病機(jī)制的研究一直是心血管疾病研究的熱點(diǎn)，以前被認(rèn)為是一種單純脂質(zhì)蓄積病變，新近研究證明，在A(yíng)S病變發(fā)生發(fā)展直至最終血栓形成的各個(gè)階段，炎癥活動(dòng)起著根本作用，而大量細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)著這一作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcell，VEC)與白細(xì)胞間相互作用是這一炎癥過(guò)程的始動(dòng)因素，其在引發(fā)和擴(kuò)大動(dòng)脈炎癥反應(yīng)中起了關(guān)鍵性

2、作用。在各種危險(xiǎn)因素作用下內(nèi)皮細(xì)胞受損、功能紊亂，分泌炎癥介質(zhì)或調(diào)解白細(xì)胞在其表面的黏附而具備潛在的炎癥作用。研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞受損情況及黏附分子的表達(dá)在防治AS具有非常重要的意義。本研究通過(guò)建立兔高脂模型，采用免疫組化的方法檢測(cè)在早期A(yíng)S形成中不同時(shí)間段血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(vascularcellularadhesionmolecule-1,VCAM-1)和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(plateletendothelialcelladhesi

3、onmolecule-1，PECAM-1)的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并應(yīng)用原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope，AFM)觀(guān)察VEC膜的超微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)演變，闡明VEC和黏附分子在A(yíng)S形成中的作用。以及應(yīng)用阿托伐他汀(atorvastatin)干預(yù)后的影響，來(lái)探討他汀類(lèi)藥在抗AS中的非降脂作用的可能機(jī)制。 方法：新西蘭純種雄性大白兔88只，按清潔級(jí)動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，體重1.8-2.5Kg，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照

4、組(C組)24只：喂以普通顆粒兔飼料;AS模型組(AS組)32只：喂以高脂飲食；atorvastatin組(D組)32只：高脂飲食喂養(yǎng)，同時(shí)予atorvastatin(4mg/kg.d)灌胃。分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及第2、4、6、8周末5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，記錄兔體重。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始隨機(jī)抽取10只兔，空腹抽取耳沿靜脈血行有關(guān)化驗(yàn)，并于實(shí)驗(yàn)的2、4、6、8周末隨機(jī)處死兔6-8只，抽取下腔靜脈血，測(cè)定血脂、轉(zhuǎn)氨酶、磷酸肌酸激酶，同時(shí)取胸主動(dòng)脈弓處血管制作石蠟切片

5、，分別進(jìn)行常規(guī)VCAM-1和PECAM-1免疫組化染色，并用圖像分析；取胸主動(dòng)脈中段標(biāo)本平鋪固定于載玻片上，應(yīng)用AFM觀(guān)察內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果： 1大體標(biāo)本肉眼觀(guān):C組兔主動(dòng)脈壁薄，有韌性，不易拉斷，內(nèi)膜呈透明色，無(wú)斑塊形成。AS組隨時(shí)間延長(zhǎng)血管壁逐漸變厚，脆性增加，易拉斷，內(nèi)膜呈灰白色，明顯斑塊形成，第8周有粥樣斑塊潰瘍糜爛改變。D組動(dòng)脈壁較AS組薄，略厚于C組，可見(jiàn)較少局限性的斑塊形成，但隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸好轉(zhuǎn)

6、，各期均明顯好于同期A(yíng)S組。 2C組血脂在實(shí)驗(yàn)前后無(wú)明顯變化，而AS組和D組血漿血脂水平包括膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)在2、4、6、8周末時(shí)較實(shí)驗(yàn)前及C組均已明顯升高；同期D組各項(xiàng)血脂水平均明顯低于A(yíng)S組(均P＜0.001)，高于C組(均P＜0.001)。 3實(shí)驗(yàn)前后及三組間血漿轉(zhuǎn)氨酶、磷酸肌酸激酶水平無(wú)明顯差別(P＞0.05)。 4在C組胸主動(dòng)脈VCAM-1無(wú)表達(dá)，PECAM-1在

7、血管內(nèi)皮細(xì)胞間可見(jiàn)少量表達(dá)。AS組胸主動(dòng)脈VCAM-1免疫反應(yīng)呈陽(yáng)性、PECAM-1免疫反應(yīng)陽(yáng)性范圍及程度均高于C組。D組胸主動(dòng)脈VCAM-1、PECAM-1免疫反應(yīng)陽(yáng)性范圍及程度均低于同期A(yíng)S組，至第8周幾乎無(wú)表達(dá)。 5AFM下VEC的超微結(jié)構(gòu)變化：(1)50μm大范圍掃描：C組VEC呈梭形，排列規(guī)整，其長(zhǎng)軸與血液流動(dòng)方向一致；AS組隨時(shí)間不同內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生了動(dòng)態(tài)改變，細(xì)胞形態(tài)變成球形、三角形、不規(guī)則形等多種形態(tài)、體積變大腫脹，

8、排列不規(guī)則，極相紊亂。(2)1μm及500nm掃描可見(jiàn)：C組VEC膜蛋白由圓形、橢圓形等大小較一致的顆粒樣隆起構(gòu)成，隆起結(jié)構(gòu)光滑、飽滿(mǎn)，排列疏密均勻一致，各隆起間界限分明。AS組細(xì)胞膜蛋白由三角形、多角形、不規(guī)則形等大小不一的隆起組成，隆起結(jié)構(gòu)起伏較大，排列疏密明顯不均，隆起表面凹凸不平，各隆起間界限隨時(shí)間推移逐漸變得模糊不清，偶見(jiàn)孔洞。8周末細(xì)胞膜多由不規(guī)則形大小相差極為懸殊的隆起組成；隆起間有許多孔洞。D組隨時(shí)間推移VEC形態(tài)、排列

9、及膜蛋白結(jié)構(gòu)更接近C組。 6500nm水平下對(duì)VEC膜粗糙度分析：AS組隨時(shí)間延長(zhǎng)粗糙度逐漸增加，與C組和D組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。D組細(xì)胞膜粗糙度高于C組(P＜0.01)。 結(jié)論： 1AFM可以清楚直觀(guān)地觀(guān)察到AS時(shí)VEC的超微結(jié)構(gòu)及三維成像情況。 2在A(yíng)S形成中，VEC的超微結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的推移表現(xiàn)出一個(gè)動(dòng)態(tài)變化，提示VEC受損可能是AS發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VEC膜粗糙度的改變可能更易于白