重型肝炎小鼠模型肝細(xì)胞死亡機(jī)制及其基因干預(yù)的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 HBV感染在發(fā)展中國家和亞太地區(qū)的流行非常嚴(yán)重，我國是HBV感染高發(fā)地區(qū)，人群攜帶率約9～10[％]，由HBV引起的重型肝炎是常見的傳染病。重型肝炎是急驟發(fā)生廣泛性肝細(xì)胞壞死而引起重度肝功能障礙，出現(xiàn)以肝性腦病為主的肝功能衰竭癥狀之高危疾病。該病病情嚴(yán)重，發(fā)展迅猛，發(fā)病機(jī)制尚不明了，臨床缺乏上特異、有效的治療靶點(diǎn)和干預(yù)手段，除非實(shí)施緊急肝移植，絕大部分患者預(yù)后不良。因此探索重型肝炎肝細(xì)胞死亡機(jī)制，并開發(fā)針對(duì)其

2、發(fā)病機(jī)制、阻斷病理衍變過程的基因治療手段正在成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向。
　　 新近發(fā)現(xiàn)的纖維介素(fibroleukin)或fgl2凝血酶原酶(簡稱fgl2)蛋白屬于纖維蛋白家族中的一員，由活化的巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，具有凝血酶原酶的活性，能催化凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，啟動(dòng)凝血過程。近來在重型肝炎患者和小鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)纖維介素(fgl2)與重型肝炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 基因水平干預(yù)基因“有害”高

3、表達(dá)可以更好地闡明該基因在疾病的發(fā)生發(fā)展中重要作用，也為探索人類重型肝炎臨床治療方法提供了新的思路。使外源基因如何高效快捷導(dǎo)入肝臟一直是該領(lǐng)域研究的瓶頸之一。研究發(fā)現(xiàn)尾靜脈高壓注射可以使質(zhì)粒DNA在小鼠肝臟獲得高效表達(dá)。尾靜脈高壓注射，就是將大體積的裸質(zhì)粒DNA溶液經(jīng)小鼠尾靜脈快速注入，大量的質(zhì)粒溶液導(dǎo)致循環(huán)血量的急劇增加，超過心臟負(fù)荷，血液積聚在肝竇中不能回流，延長了質(zhì)粒DNA在肝竇中的停留時(shí)間，從而被肝組織細(xì)胞攝取。該方法可以廣泛應(yīng)

4、用于肝臟疾病基因干預(yù)的研究。
　　 肝細(xì)胞凋亡在肝病的發(fā)生過程中起重要作用，各種原因?qū)е碌母嗡ソ叨即嬖诟渭?xì)胞的凋亡。在LPS+D-GalN的FHF模型中，LPS的毒性實(shí)際上是由于嚴(yán)重的凋亡性肝損傷和肝細(xì)胞完全破壞所引起的。在重型肝炎的發(fā)病過程中，F(xiàn)as與TNF系統(tǒng)的激活，Bcl-2家族調(diào)控蛋白比例的失衡等因素都會(huì)影響肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。另外，mfgl2在肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生過程中有重要作用，IFN-γ和TNF-α在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞

5、凋亡依賴于mfgl2的表達(dá)。然而，有關(guān)肝細(xì)胞凋亡在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠重型肝炎肝衰竭中的重要作用還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此研究肝細(xì)胞凋亡及其調(diào)控機(jī)制對(duì)重型肝炎肝損傷發(fā)生機(jī)理的理解具有重要意義。
　　 具體研究目的如下：
　　 1.建立一簡單可靠的重型肝炎小鼠模型，用于重型肝炎發(fā)病機(jī)制和干預(yù)治療的研究。
　　 2.針對(duì)重型肝炎發(fā)病關(guān)鍵基因mfgl2構(gòu)建一反義質(zhì)粒，抑制小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞mfgl2的表達(dá)

6、。
　　 3.研究mfgl2反義質(zhì)粒對(duì)重型肝炎小鼠體內(nèi)mfgl2表達(dá)的改變，以及對(duì)小鼠重型肝炎病情發(fā)展的影響。
　　 4.研究凋亡相關(guān)蛋白在重型肝炎小鼠模型肝組織中的表達(dá)及其促肝細(xì)胞凋亡的作用。
　　 方法：
　　 1.采用MHV-3感染Balb/cJ小鼠制造重型肝炎動(dòng)物模型；重型肝炎小鼠肝組織HE染色進(jìn)行HAI評(píng)分，并分析血清學(xué)指標(biāo)；免疫組化檢測(cè)mfgl2的肝組織表達(dá)和纖維蛋白的沉積；構(gòu)建mfgl2反義

7、質(zhì)粒和對(duì)照正義質(zhì)粒，細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染mfgl2反義質(zhì)粒，并通過Real-time PCR、Western-blot技術(shù)檢測(cè)mfgl2反義質(zhì)粒的體外干預(yù)效應(yīng)，通過檢測(cè)細(xì)胞PCA活性證實(shí)mfgl2反義質(zhì)粒的干預(yù)后效應(yīng)；通過尾靜脈高壓注射將目的基因?qū)胄∈蟾闻K，并檢測(cè)目的基因在肝臟的表達(dá)效率；mfgl2反義質(zhì)粒高壓注射后，檢測(cè)小鼠肝組織病理、血清生化學(xué)變化，并觀察重型肝炎小鼠生存率的改變；通過Real-time PCR、免疫組化、原位雜交技術(shù)檢測(cè)

8、mfgl2反義質(zhì)粒干預(yù)后的小鼠肝臟mfgl2的表達(dá)情況；
　　 2.TUNEL法檢測(cè)MHV-3誘導(dǎo)的重型肝炎小鼠模型肝細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡指數(shù)；
　　 3.免疫組化技術(shù)檢測(cè)重型肝炎小鼠肝細(xì)胞Fas和TNFR1的表達(dá)情況；Western-blot檢測(cè)重型肝炎小鼠肝細(xì)胞Bax和Bcl-2的表達(dá)水平，并計(jì)算Bax/Bcl-2比值。
　　 結(jié)果：
　　 1.MHV-3感染后Balb/cJ小鼠肝組織出現(xiàn)大片肝細(xì)

9、胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤，HAI評(píng)分逐步升高，72h達(dá)到最高水平(16.0±1.4)；MHV-3感染后Balb/cJ小鼠血清酶ALT、AST，以及血清Tbil逐步升高，72h達(dá)到最高水平(8192.3±224.4 IU/L，9410.3±954.4 IU/L，11.6±0.75 umol/L)，血清白蛋白逐步降低，72h達(dá)到最低水平(19.6±1.25 g/L)。
　　 2.成功構(gòu)建mfgl2反義質(zhì)粒和對(duì)照正義質(zhì)粒，并鑒定無誤；mf

10、gl2反義質(zhì)粒細(xì)胞水平顯著抑制mfgl2的表達(dá)，并抑制Raw264.7細(xì)胞在IFN-γ刺激后的PCA活性；尾靜脈高壓注射可以將目的基因?qū)胄∈蟾闻K，24h重復(fù)注射可以使表達(dá)效率提高到40[％]。Mfgl2反義質(zhì)粒高壓注射后，重型肝炎小鼠生存率從0提高到33.3[％]，并顯著改善肝組織病理學(xué)變化和血清學(xué)指標(biāo)；mfgl2反義質(zhì)粒高壓注射后，顯著抑制mfgl2在重型肝炎小鼠模型體內(nèi)的表達(dá)，并顯著減少纖維蛋白在肝臟的沉積。
　　 3.M

11、HV-3誘導(dǎo)的重型肝炎小鼠模型與對(duì)照組(MHV-3感染A/J鼠)相比，肝細(xì)胞出現(xiàn)大片凋亡，凋亡指數(shù)逐步升高，72h達(dá)到最高水平(79.8±7.4[％])；MHV-3誘導(dǎo)的重型肝炎小鼠模型與對(duì)照組相比，肝細(xì)胞表面Fas和TNFR1表達(dá)強(qiáng)陽性，同時(shí)Bax蛋白表達(dá)升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax/Bcl-2比值升高。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究成功地建立了MHV-3誘導(dǎo)的重型肝炎小鼠模型，并通過尾靜脈高壓注射技術(shù)將外