肝細(xì)胞去分化及其機(jī)制.pdf

1、目的:
　　傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為組織發(fā)育和細(xì)胞分化是一個(gè)單向性的過(guò)程，即由干細(xì)胞/前體細(xì)胞向體細(xì)胞分化。因此，在組織正常更新或損傷情況下，干細(xì)胞/前體細(xì)胞在組織再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，到目前為止，干細(xì)胞/前體細(xì)胞的這種重要作用只在僅有的幾個(gè)器官中得到證實(shí)，其他大多數(shù)器官中則缺乏相應(yīng)的研究證據(jù)。肝臟就是其中之一。
　　肝臟中的干細(xì)胞/前體細(xì)胞稱為肝前體細(xì)胞（Hepatic Progenitor Cells，HPCs），其可向肝細(xì)

2、胞和膽管上皮細(xì)胞雙向分化。由于HPCs可表達(dá)多種細(xì)胞標(biāo)志物而缺乏特異性標(biāo)志物，其來(lái)源到目前為止尚不十分清楚。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為HPCs來(lái)自膽管末端的Hering管，也有研究提示骨髓干細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等也是HPCs來(lái)源之一。此外，也有研究顯示肝細(xì)胞可作為HPcs的另一來(lái)源。肝臟由于其特殊的位置和功能，使其成為生物體中非常特殊的器官之一。作為其主要實(shí)質(zhì)構(gòu)成及功能發(fā)生單位，肝細(xì)胞也因此擁有與其他體細(xì)胞不同的生理特性，如可無(wú)限增殖及向膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化

3、等。最新的體內(nèi)外研究顯示肝細(xì)胞也可去分化為HPCs。然而，這些研究均缺乏嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖V系追蹤證據(jù)加以證實(shí)，也未對(duì)肝細(xì)胞去分化的機(jī)制做深一步的研究。
　　肝細(xì)胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor4α，HNF4α)是肝臟富集的一類轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用。研究顯示HNF4α還可促進(jìn)肝癌細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化，但其在成熟肝細(xì)胞去分化中的作用未見報(bào)道。
　　基于以上研究背景，本研究利用多種轉(zhuǎn)基

4、因小鼠及動(dòng)物模型明確不同肝損傷情況下肝細(xì)胞在肝臟再生中的作用及肝細(xì)胞是否可作為肝前體細(xì)胞來(lái)源之一，并初步探討其機(jī)制。
　　方法:
　　一、肝細(xì)胞特異性表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建
　　甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)為肝細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白。本研究采用mTomato-mGFP雙重?zé)晒鈽?biāo)記小鼠，攜帶TBG啟動(dòng)子及內(nèi)含子的血清Ⅷ型腺相關(guān)病毒(AAV8-TBG)可驅(qū)動(dòng)下游基因在成熟肝細(xì)胞中特異表達(dá)。小鼠尾靜脈注射攜帶C

5、re重組酶基因的AAV8-TBG(AAV8-TBG-Cre)后使肝細(xì)胞特異性標(biāo)記GFP而呈現(xiàn)綠色熒光，其他非肝細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。
　　二、明確急性肝損傷時(shí)肝臟再生情況
　　mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre標(biāo)記肝細(xì)胞后，給予腹腔注射四氯化碳每周兩次注射兩周，或行肝大部切除術(shù)，構(gòu)建急性肝損傷模型。觀察肝臟組織中紅色和綠色熒光標(biāo)記區(qū)域的細(xì)胞變化情況。免疫熒光檢測(cè)HNF4α與紅色或綠色熒光表達(dá)。

6、　　三、明確慢性肝損傷時(shí)肝細(xì)胞是否可以去分化為HPCs
　　上述老鼠繼續(xù)延長(zhǎng)DDC飲食造模時(shí)間，免疫熒光檢測(cè)PCK、EpCAM、Sox9等HPCs標(biāo)志物表達(dá)并追蹤其熒光標(biāo)記。在CDE飲食模型中重復(fù)觀察上述現(xiàn)象。分離小鼠原代肝細(xì)胞，收集RNA和蛋白，RT-PCR和Western blot檢測(cè)成熟肝細(xì)胞及HPCs相關(guān)基因表達(dá)。
　　四、初步明確HNF4α表達(dá)在肝細(xì)胞去分化中的作用
　　分離DDC飲食不同時(shí)間點(diǎn)小鼠原代肝細(xì)胞

7、，收集RNA和蛋白，RT-PCR和Westernblot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)HNF4α表達(dá)量變化。將mTomato-mGFP小鼠與HNF4aflox/flox小鼠雜交后，尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre，構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除HNF4α轉(zhuǎn)基因小鼠，免疫熒光檢測(cè)肝臟組織中Sox9的表達(dá)。分離小鼠原代肝細(xì)胞，收集RNA和蛋白，RT-PCR和Western blot檢測(cè)成熟肝細(xì)胞及HPCs相關(guān)基因表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　一、成功構(gòu)建肝細(xì)胞

8、特異性表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠
　　mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre后可見肝臟組織內(nèi)除匯管區(qū)及間質(zhì)部位細(xì)胞表達(dá)綠色熒光外，幾乎所有肝細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。免疫熒光對(duì)多種細(xì)胞特異性標(biāo)志物如HNF4α、PCK、Sox9、GFAP、α-SMA、F4/80、CD34檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞均為肝細(xì)胞，而其他細(xì)胞包括膽管上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等則表達(dá)紅色熒光。表明該模

9、式動(dòng)物可明確的區(qū)分出肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞，結(jié)合免疫熒光技術(shù)我們可直觀的探究肝細(xì)胞的來(lái)源和去路，是進(jìn)行譜系追蹤研究肝細(xì)胞去分化的理想動(dòng)物模型。
　　二、急性肝損傷后再生肝細(xì)胞來(lái)源于肝細(xì)胞自我復(fù)制
　　mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre標(biāo)記肝細(xì)胞，腹腔注射四氯化碳或行肝大部切除術(shù)構(gòu)建急性肝損傷模型，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)門靜脈區(qū)域紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增加，也未發(fā)現(xiàn)紅色熒光標(biāo)記的肝細(xì)胞樣細(xì)胞的出現(xiàn)，HNF

10、4α檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)所有HNF4α陽(yáng)性的細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光，未見紅色熒光標(biāo)記的HNF4α陽(yáng)性的細(xì)胞出現(xiàn)。提示急性肝損傷后再生過(guò)程中殘存肝細(xì)胞自我復(fù)制是新生肝細(xì)胞的唯一來(lái)源。
　　三、慢性肝損傷時(shí)肝細(xì)胞可發(fā)生去分化
　　1、繼續(xù)進(jìn)行DDC飲食4-12周，每隔一周檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肝臟再生情況。發(fā)現(xiàn)隨著DDC飲食時(shí)間的延長(zhǎng)，散在的PCK陽(yáng)性的細(xì)胞逐漸增多，至DDC飲食6周開始出現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的PCK陽(yáng)性的細(xì)胞并逐漸增多。多種HPCs標(biāo)志物檢

11、測(cè)也發(fā)現(xiàn)了散在的綠色熒光標(biāo)記的Sox9、EpCAM陽(yáng)性的細(xì)胞。說(shuō)明DDC飲食所致慢性肝損傷達(dá)一定程度時(shí)部分肝細(xì)胞發(fā)生了去分化。
　　2、普通C57小鼠進(jìn)行DDC飲食造模4周，每隔一周分離各時(shí)間點(diǎn)小鼠原代肝細(xì)胞，收集RNSA和蛋白。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)成熟肝細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)逐漸降低，HPCs相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)明顯增加。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著DDC飲食延長(zhǎng)，Sox9的表達(dá)逐漸增加。分別在RNA和蛋白水平證實(shí)了肝細(xì)胞去分化

12、現(xiàn)象。
　　3、mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre標(biāo)記肝細(xì)胞，給予CDE飲食造模，觀察肝臟組織再生情況。我們同樣觀察到隨著CDE飲食的延長(zhǎng)，門靜脈區(qū)域紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。至CDE飲食6周開始出現(xiàn)散在的綠色熒光標(biāo)記的Sox9、PCK、EpCAM陽(yáng)性的細(xì)胞。提示CDE飲食所致慢性肝損傷中肝細(xì)胞去分化現(xiàn)象仍然存在。
　　四、肝細(xì)胞特異性敲除HNF4α后可發(fā)生自發(fā)去分化
　　1、普通C5

13、7小鼠進(jìn)行DDC飲食造模4周，每隔一周分離各時(shí)間點(diǎn)小鼠原代肝細(xì)胞，收集RNA和蛋白，RT-PCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著DDC飲食的延長(zhǎng)，HPCs標(biāo)志物表達(dá)量增加的同時(shí)HNF4α的表達(dá)量逐漸減少。提示肝細(xì)胞內(nèi)HNF4α可能在損傷后肝細(xì)胞去分化過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。
　　2、構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除HNF4α小鼠，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在敲除HNF4α的肝細(xì)胞中，約50％的細(xì)胞表達(dá)Sox9。分離原代肝細(xì)胞，收集RNA和蛋白。R

14、T-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HNF4α敲除小鼠成熟肝細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)逐漸降低，HPCs相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)明顯增加。Western blot檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)HNF4α敲除小鼠肝細(xì)胞中Sox9的表達(dá)明顯增加。提示HNF4α在維持成熟肝細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)下降是調(diào)控肝細(xì)胞去分化的重要機(jī)制之一。
　　結(jié)論:
　　一、急性肝臟損傷時(shí)肝細(xì)胞通過(guò)自我復(fù)制完成肝臟再生。
　　二、慢性肝臟損傷時(shí)肝細(xì)胞可去分化為HPCs。
　　三、HNF