基于雙基因載體系統(tǒng)的擬南芥維生素C合成代謝調(diào)控研究.pdf

1、基 于 雙 基 因載 體 系 統(tǒng) 的擬 南 芥 維 生 素 C合 成 代 謝 調(diào) 控 研 究M E T A B O L I CE N G IN E E R I N GO FA S C O R B I CA C IDS Y N T H E S I SP A T H W A YI N A 人 刀 及 動 l0 }召 L 夕 B YAD U A L 一 G E N EV E C T O RS Y S T E M復(fù) 旦 大 學(xué) 生命 科 學(xué) 學(xué)

2、 院 ，遺 傳 學(xué)研 究 所 ，遺 傳 工 程 國家 重 點(diǎn)實 驗 室復(fù) 旦一 交 大 一 諾 丁 漢 植物 生 物 技 術(shù) 研 發(fā) 中心上 海 市 邯 鄲 路 220 號 ， 中 國 ，200433S ta teK e yL a b o r a to ryo fG e n e tieE n g in e e r in g ， I n stitu teo fG e n e tie s ，F(xiàn) u d a n 一 S J T U 一 N o

3、 ttin g h a mP la n tB io te e h n o lo g y R & D C e n te r ，S eh o olo fL ifeS eien ees， F u d a nU n i v ersity2 2 0H a n d a nR o a d ， S h a n g h a i， P . R . C h in a2 0 0 4 3 3周 宙指 導(dǎo) 教 師 :唐 克 軒 教 授20 1 0 . 0

4、5 . 1 5、基 于雙基 因載體 系統(tǒng) 的擬 南芥 維生素 C 合 成代 謝 調(diào)控研 究2.1. 3 使 用 K O DPlus 進(jìn) 行 P C R 獲 得 目的 基 因一 ~~. ” 一 . . …” ” ” ~一 ” ~“ 一 ~一 ” . ~…一 18 -2.1. 4 片 段 尾 端 加 A …“ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5、. . . 一 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . 一 . . . . . . . ……“ . . . . . . . . 一 19 -2.2 載 體 構(gòu) 建 方 法 …” ” ” 二 ” “ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6、. . . . . . . . . . …… . “ . . . . . . . . . . . . ……” . 一 ” …~一 19 -2.2.1 質(zhì) 粒 抽 提 . . . ……， 二 “ . . . ……” . . . ……“ . . . . . . . . 一 . . ……“ . …” . . . . . . . . . ……” . . . . . . . . . . . . .’ . . . . . . . . . . 一 一

7、 19 -2.2.2 酶 切 . ” “ . . . . . . . . . ……” ” . …” …… . “ . . . . . . . . . . . . . . ……” …” “ . .. . . . . . 一 . . 一 ” . ” ” . “ “ . . . . . . . . . . ……” 一 19 -2 . 2 .3 連 接 . . . . . . . ……” ” …“ . …” . . . . . . . . .

8、. . . . . . . . . ……“ …， 二 ， . . . . . . . . . . . . ……“ 二 “ . “ 二 ” . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . 一 20 -2.2.4 大 腸 桿 菌 感 受 態(tài) 制 備 ……~. . . . . ……” ” … “ . . …“ . ……” .. “ . . . . . . . . . 一 . . ……” ” ” .. . …

9、“ . . 一 20 -2.2.5 大 腸 桿 菌 轉(zhuǎn) 化 . .. . . . . . . . . . . . 一 . . . . . …… ， . . . . . . . . . . . ……” . …” .. . . . . . . . . . . . . . . . . . …… ， ……” . . . . . . . . 一 20 -2.2.6 檢 測 陽性 轉(zhuǎn) 化 子 . . ……” . . ……” 二 ” . . .. .

10、 . . . . . . ……” . . … …“ 二 :.. . . . 一 . . …” . ” 二 ” . “ .. . . ……” 一 20 -2.3 農(nóng) 桿 菌 培 養(yǎng) 與 轉(zhuǎn) 化 . … “ .. . . . . . . . . . . . . ……” 二 “ . . . . . . . . . . . ……” . ” . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . ……” 二 “ . .

11、. . . . . . . . . . 一 21 -2.3.1 農(nóng) 桿 菌 培 養(yǎng) . . …“ . . . . . . . . . . . . . . . . . ……” . ” . “ . “ . ” . . ……” . ” …” .. ” . “ . . . . . . . . . ……” . ” ” “ “ 二 “ “ 一 21 -2. 3.2 農(nóng) 桿 菌 轉(zhuǎn) 化 …“ “ . ” . ” …” . . . . ……” . “

12、. “ …” . ” ……” 二 ” . ” ” ” “ “ . . . ……” . ……” . “ . .. . . ……” 一 2 1 -2.4 擬 南 芥 的培 養(yǎng) 與轉(zhuǎn) 化 . . . . . 一 . . . . . . . ……” 二 “ ” . …“ “ . . . ……” 二 ” 二 “ . . . 一 . . . . . . ……” …” 二 “ …“ . … -…” 一 21 -2.4. 1 擬 南 芥 的播 種 與

13、培養(yǎng) ……” .. . . . . . . . . . . . . . . ……” . ” . “ 二 “ . . . . . . . . . . . . . . …… “ . . . . . . . ……” . ” . . 一 21 -2.4. 2 擬 南 芥 轉(zhuǎn) 化 . . . . . . . . . . ……” ” ” . “ . “ “ . . . . . ……” ” . ” . .. . . . . . . ……” . . …

14、” ” ” “ “ . “ . “ 二 ” . ” . “ ” ” . 一 22 -2.5 轉(zhuǎn) 基 因擬 南 芥 的分 子檢 測 . ” 二 ” .. . .. 一 . . 一 一 ~一 ” ” “ ” “ . “ 二 “ “ . 一 ” ” “ ” . “ 一 ~一 ” 一 ” . ” “ “ “ “ 一 23 -2.5.1 轉(zhuǎn) 基 因擬 南 芥 D N A 的抽 提 “ . . . ……” ” . ” . ” . “ . . . .

15、 ……” . ， ” ” ” “ “ . . . ……” . ” ” “ . “ ……” 一 23 -2.5.2 轉(zhuǎn) 基 因擬 南 芥 基 因組 D N A 的 P C R 分 析 . “ 二 “ . . . . . . . . . …… ” .. “ . . . . ……” ” ” ” . “ “ “ 一 23 -2.5. 3 擬 南 芥 組 織 總 R N A 小 量 抽 提 ” “ 二 “ . . . . ……” . ” ” “

16、二 “ . “ . . . ……” . ” ” ” . …“ …“ ……“ ” 一 23 -2.5.4 反 轉(zhuǎn) 錄 . ” ” ” . ” “ …” ” “ . . . . . . . . .. . . ……” . ” . “ . “ . ……” 二 ” ” ” . ” ” ” “ 二 “ . “ …” . …” ” ” . “ 二 “ . ‘ 二 ~一 24 -2.6H P L C 檢 測 維 生 素 C 含 量 . ” “ ” “

17、. “ 一“ 二 ~” ” ” ” ” ” 二 “ . “ “ “ 一 ” ” ” ” ” .. ” ” ” “ “ 一 ” ” ” ” ” ” “ “ “ “ 一 26 -2.6. 1 樣 品 處 理 二 “ ~一 . . . 一 ~一 ~二 ~” . “ .. “ 一 ~二 ~“ . ” ” :. “ “ . “ . . 一 一 . 一 ” . ” ” “ . “ . “ 一 ~. 一 … “ 一 26 -2.6. 2 高 效 液

18、相 似 PL C) 條 件 一 ” ” 一 ” ” ” “ . “ 一” 一” . ” ” ” .. “ :.~一 ~~. ” ” ” ” “ “ 一“ 一 ” 一 ” 一 26 -2.6. 3 繪 制 標(biāo) 準(zhǔn) 曲線 二 ” ” …“ . ” . . . . . . . . ……” ” “ 二 “ 二 “ “ 二 ” . . ……” “ . “ . …“ . . . . ……， ” ” “ . “ . . …” . 一 26 -2.6.

19、4 測 定 樣 品 A sA 含 量 . “ ” . “ “ . . . ……” ” . ” . ” . ” . “ 二 ” 一 ” . ” ” . ” ” . “ 二 “ ……” 二 ” . .. … “ ……~一 27 -第 三 章 擬 南 芥 合 成 途 徑 雙 基 因轉(zhuǎn) 化 一” ” . ” ” “ “ “ 一“ 一 ~. ~二 ” ” . “ “ . “ ~” . ” ” 二 ” ” ” .. “ “ . “ ~一 ~. ”

20、.. ” “ . 一 . 一 28 -1 擬 南 芥 A sA 合 成 途 徑 基 因 的克 隆 和 單 基 因載 體 構(gòu) 建 . … ” 二 “ “ “ “ 一 “ ~一 ” ” ” “ .“ . “ . 一 一 …一 28 -1. 1 基 因特 異 引 物 的設(shè) 計 . ~” . 一 .- . …~… ~” 一 . . 一 一 ~. …” ” ” . ” :.“ . . . 一 一 一 ” ” 二 ” “ “ ” 一~~” ~…”

21、…一 28 -1. 2 基 因編 碼 區(qū) 的 克 隆 一~~” ” 二 “ . ” “ “ 一 ~. ~一 ” ” ” . ” . ” . “ “ “ ~. ~一~一 ” ” ” ” .. “ . “ . ” . ~一 ” ” . …一 2 8 -L 3 基 因 點(diǎn) 突 變 . ” ” ” ” ” ” . … . ” “ ~~” ~一 ” . ” ” . ” . ” 二 “ “ . ” . ~一 ~” . “ . ” ” ” “ . “

22、 . ~~一 ” . ~. ” ” ” ” . ” “ “ “ 一 30 -L 4 植 物 單 基 因表 達(dá) 載 體 的構(gòu) 建 . ” . ” “ . … “ . 一 ~. ~” ” ” 二 ~” 一 . 一 ~一“ ” ” ” ” ” ” “ . “ 一 ” ~. ~. 一 32 -2 植 物 雙 基 因表 達(dá) 載 體 的構(gòu) 建 . “ . “ “ 一 ” . ~一 ” . ~” .. “ “ 一 ~. ~. ~一 ” ” ” ” ”

23、 “ . “ ” “ “ 一 “ “ . ~. ~” “ . “ ” . … ~~一 32 -2.1 基 因表 達(dá) 框 引物 的設(shè) 計 . ~一 ” …~. ~一 一 ~二 ~. ” .. ” ” . … ~~一~. ~. ” ” ” ” 二 ” “ . ~. 一 一 “ . ~. ” . …一 32 -2. 2 基 因 編 碼 區(qū) 的 克 隆 …~一“ 一 ~一 ~” “ ~. ” “ . “ 二 ~. ” 一 ” “ . ” 一 .

24、 一 .. … . “ . ” ~一 ~~一 ” 二 “ . ” .. … …一 33 -2.3 植 物 雙 基 因表 達(dá) 載 體 的構(gòu) 建 . . . .. .. . 一 一 ~一 ~. ~. . . . . 一 一 ~…~二 ~一 ~. ~. . . 一 一 ~. “ 一 ~…” .- . . 一 33 -3 擬 南 芥 的轉(zhuǎn) 化 和 陽 性 植 株 的獲 得 . . . . . . . . . . . . . . . . . .

25、. . . . . . . . . . . . ……” . . . . . . …… ” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 . 一 34 -3 . 1 農(nóng) 桿 菌 的 轉(zhuǎn) 化 . . . . . . . . . . ……” . . . . ……” 一 . …” ……~. . . . . . 一 “ . . . . . . . . . . . .

26、 . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … …” . . 一 3 4 -3.2 擬 南 芥 的轉(zhuǎn) 化 和 篩 選 . ” . . …~. ” . . 一 ~…~. . .. . . ……~一 “ 二 ~. 一 . . . 一 ~~一 ~…” 二 ~. 一 “ . ~. ~. 一 34 -3.3 擬 南 芥 的 分 子 鑒 定 . . ……“ . . . . . . . .

27、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……” . . . . . . . . . . . . . ……“ . . . . . . . . . . . . . ……” 二 ~一 34 -4 轉(zhuǎn) 基 因擬 南 芥 中基 因表 達(dá) 量 的分 析 …… . ” 一 . . … ~. 一 “ 一 . . . .. 一 “ ~. ” 一 一 “ . .. .. 一 ~

28、一 ~” . ” …~. 一 35 -4. 1 實 時 定 量 P C R 的 引 物 設(shè) 計 . “ . . . .. 一 ” 一 ~. . 一 . .. … . ~一 ~” . ” 二~~二 “ …~一 ” 二 “ 一“ . ~. ~. … …一 35 -4. 2 編 碼 A sA 生 物 合 成 途 徑 中各 酶 的基 因 的 總 表 達(dá) 量 的分 析 . “ . ” …~” . . . . . . 一 一 …… . ” 一 一