水稻維生素E、C代謝調(diào)控研究.pdf

1、維生素E和維生素C均是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑，對植物生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。維生素E是脂溶性的抗氧化劑，分為生育酚和三烯生育酚兩大類，生育酚存在于各種植物中，三烯生育酚主要存在在單葉子植物的種子中。維生素C又名抗壞血酸(L-ascorbic acid，AsA)，是水溶性的抗氧化劑，主要存在于大多數(shù)植物的綠色組織中。人類無法自身合成維生素E和維生素C，缺乏這兩種維生素會出現(xiàn)一些疾病，所以必須定期從日常飲食，特別是直接或間接從植物中獲取

2、。水稻是世界上重要的糧食作物之一，通過基因工程技術(shù)提高水稻中維生素E和維生素C的含量，改良水稻營養(yǎng)品質(zhì)和抗性是分子育種新的方向之一。
　　 本研究圍繞提高水稻中維生素E和維生素C含量和活性這一目標，主要開展了以下4個方面的研究:
　　 (1)了解維生素E及組分在不同水稻品種籽粒間的變異與分布，為今后水稻維生素E營養(yǎng)品質(zhì)改良提供有益的表型數(shù)據(jù);
　　 (2)過量表達維生素E合成途徑中關(guān)鍵基因，以期提高水稻中總維生素

3、E的含量或活性;
　　 (3)分析水稻中維生素C合成與代謝相關(guān)基因的表達，為了解維生素C代謝進而遺傳改良提供一定的依據(jù);
　　 (4)對維生素C合成及代謝途徑中的相關(guān)基因分別進行過量表達，以期能提高水稻中維生素C的含量。取得如下主要結(jié)果:
　　 1、水稻籽粒維生素E及組分在品種間的變異與分布。利用反相高效液相色譜法測定了18份秈稻和16份粳稻品種糙米中維生素E各異構(gòu)體的含量。結(jié)果表明，種子中各異構(gòu)體的含量在秈稻與

4、粳稻間存在顯著差異，粳稻種子中的生育酚和總維生素E含量一般要高于秈稻;秈稻種子中三烯生育酚與生育酚的比值(1.61)極顯著高于粳稻(0.95)，秈稻中以γ-三烯生育酚為主，而粳稻中主要含α-生育酚。水稻種子中同種類型異構(gòu)體（即α-型間或γ-型間）含量間具有顯著正相關(guān)，但γ-型與α-型異構(gòu)體間呈顯著負相關(guān)。這些數(shù)據(jù)為進一步研究水稻種子中維生素E的代謝調(diào)控和營養(yǎng)品質(zhì)改良提供了有益的表型數(shù)據(jù)。
　　 2、在轉(zhuǎn)基因水稻中過量表達維生素E

5、合成關(guān)鍵基因的研究。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以優(yōu)質(zhì)粳稻品種武育粳3號為受體，過量表達維生素E合成途徑中的三個關(guān)鍵酶基因，即尿黑酸香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶(homogentisate geranylgeranyl transferase，HGGT)、尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶(Homogentisate phytyltransferase，HPT)、γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-tocopherol methyltransferase，γ-TMT)，獲得

6、了大量轉(zhuǎn)基因水稻植株。分子檢測證明外源基因已整合進轉(zhuǎn)基因水稻中，并正常表達。HPLC測定結(jié)果顯示，在HGGT轉(zhuǎn)基因株系的糠層和胚乳中，總?cè)┥拥暮糠謩e是親本對照的1.52和1.67倍，且主要表現(xiàn)為γ-三烯生育酚的增加，而生育酚的合成未受影響;在HPT轉(zhuǎn)基因株系中，糠層和胚乳中總生育酚的含量分別是親本對照的1.44和2.13倍，主要表現(xiàn)為α-生育酚含量的增加。同時發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株中總?cè)┥拥暮恳灿休p微提高;在γ-TMT轉(zhuǎn)基因

7、株系中，γ-構(gòu)型大幅度轉(zhuǎn)化為α-構(gòu)型，從而同時提高了α-生育酚和α-三烯生育酚的比例。如在糠層和胚乳中，α-生育酚占總生育酚的比重分別提高到95％和98％，α-三烯生育酚占總?cè)┥拥谋戎胤謩e提高到86％和89％。
　　 3、水稻維生素C合成相關(guān)基因的表達分析。根據(jù)擬南芥中參與維生素C合成和代謝關(guān)鍵酶的氨基酸序列，經(jīng)在公共數(shù)據(jù)庫中搜索比對獲得了水稻中參與維生素C合成相關(guān)基因的信息。在此基礎(chǔ)上，利用實時定量PCR技術(shù)對這些基因在

8、水稻不同組織器官以及發(fā)育種子中的表達進行分析。結(jié)果表明:水稻維生素C合成相關(guān)基因在葉中的表達量最高。其次是葉鞘和籽粒，莖和根中的表達量最低，而幼嫩葉片中的表達水平一般高于成熟葉片。
　　 4、在轉(zhuǎn)基因水稻中過量表達維生素C代謝相關(guān)基因的研究。在水稻中分別過量表達編碼AsA生物合成途徑中的鳥苷二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-D-mannose pyrophosphorylase，GMP)、鳥苷二磷酸-D-甘露糖-3，5-表異

9、構(gòu)酶（GDP-D-mannose-3，5-epimerase，GME）、鳥苷二磷酸-L-半乳糖磷酸化酶( GDP-L-galactose phosphorylase，GGP)、L-半乳糖-1-P-磷酸酯酶（L-galactose1-pphosphatase，GPP)、L-半乳糖脫氫酶(L-galactose dehydrogenase，GDH)和代謝途徑中的脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbic acid，DHAR)基因，獲

10、得了大量的轉(zhuǎn)基因水稻植株。分子檢測證明外源基因已整合進轉(zhuǎn)基因水稻中，并正常表達。用HPLC法對轉(zhuǎn)基因水稻葉片中AsA含量的測定結(jié)果顯示，分別過表達這些基因后均可不同程度地提高水稻葉片中AsA的含量。GMP是AsA進入L-半乳糖途徑的第一個關(guān)鍵酶，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達GMP基因比其他各基因?qū)sA含量的提高更為顯著，其次是GGP基因。在轉(zhuǎn)GMP基因株系中，AsA含量最高的系是對照的2.52倍;在轉(zhuǎn)GME基因株系中AsA含量最高是對照的1.6