鞘內(nèi)注射人IL-10基因修飾的間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用.pdf

1、本文第一部分構(gòu)建bIL10和EGFP基因的雙順反子重組腺病毒載體及其在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá) 目的:構(gòu)建帶有hIL-10基因的腺病毒載體，并感染大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(ratmesenchymal stem cells，rMSCs)后，進(jìn)一步檢測(cè)hIL-10表達(dá)從而獲得有生物活性hIL-10修飾的rMSCs(hIL10-rMSCs)。 方法:以pSNAV2.0-hIL10重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得hIL10cDNA片段，

2、經(jīng)酶切連接到帶有EGFP標(biāo)記的pDC316-IRES-EGFP-lacZalpha載體質(zhì)粒上，PmeI線性化重組質(zhì)粒pDC316-hIL10-IRES-EGFP，與腺病毒包裝系統(tǒng)：AdMax轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，包裝產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒，經(jīng)反復(fù)感染293細(xì)胞擴(kuò)增病毒后，進(jìn)行離子交換法純化病毒，并測(cè)定病毒顆粒數(shù)、滴度。所獲重組腺病毒感染rMSCs后，通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察測(cè)定重組腺病毒感染rMSCs的感染率，Western- b

3、lotting法測(cè)定rMSCs hIL-10蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論:已成功構(gòu)建含hIL10和EGFP基因的雙順反子重組腺病毒載體，其對(duì)rMSCs具較高感染率并能很好地表達(dá)目的基因hIL10，這為下一步hIL-10免疫抑制治療研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分脊髓膠質(zhì)細(xì)胞及前炎性細(xì)胞因子在長(zhǎng)春新堿致神經(jīng)病理性疼痛中的作用及機(jī)制 目的:探討脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞以及前炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞

4、介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)在長(zhǎng)春新堿致神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。 方法:雄性SD大鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組。模型組通過(guò)大鼠腹腔內(nèi)重復(fù)注射長(zhǎng)春新堿建立神經(jīng)病理性疼痛模型；以第1次注射長(zhǎng)春新堿為第1天，模型組第1～5天和第8～12天腹腔注射0.1mg·(kg·d)-1長(zhǎng)春新堿注射液(以生理鹽水稀釋至1mL)。對(duì)照組注射1mL生理鹽水，余處理同模型組。通過(guò)檢測(cè)機(jī)械性痛閾(PWT)和熱痛敏潛伏期(PWL

5、)來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物痛行為學(xué)改變。采用免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等方法，檢測(cè)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42的表達(dá)以及脊髓前炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNFαmRNA表達(dá)的變化，評(píng)價(jià)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況及脊髓前炎性細(xì)胞因子表達(dá)與疼痛行為改變的關(guān)系。 結(jié)論:大鼠腹腔內(nèi)重復(fù)注射長(zhǎng)春新堿成功地建立了化學(xué)藥物致神經(jīng)病理性疼痛模型；長(zhǎng)春新堿誘發(fā)的脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化及前炎性細(xì)胞因子IL-1β

6、、IL-6和TNFα的表達(dá)增加，可能在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起著重要的作用。 第三部分鞘內(nèi)注射人IL-10基因修飾的間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用 目的:人IL-10基因修飾的間質(zhì)干細(xì)胞(hIL10-MSCs)經(jīng)皮鞘內(nèi)注射入長(zhǎng)春新堿致神經(jīng)病理性疼痛大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，觀察其在蛛網(wǎng)膜下腔存活情況及其對(duì)大鼠的鎮(zhèn)痛作用及可能機(jī)制。 方法:長(zhǎng)春新堿反復(fù)腹腔注射制備神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型。模型大鼠60

7、只隨機(jī)分為hIL10-MSCs組、空載體-MSCs組及對(duì)照組，每組20只。hIL10-MSCs組和空載體-MSCs組分別經(jīng)皮鞘內(nèi)注射hIL10-MSCs細(xì)胞懸液(1×106cells/mL)以及空載體-MSCs細(xì)胞懸液(1×106cells/mL)各30uL；對(duì)照組經(jīng)皮鞘內(nèi)注射生理鹽水30uL。各組大鼠分別于鞘內(nèi)注射前，鞘內(nèi)注射后3、7、14天測(cè)定機(jī)械性痛閾(PWT)和熱痛敏潛伏期(PWL)，同時(shí)應(yīng)用熒光激發(fā)、ELISA法、免疫組化及W

8、B技術(shù)檢測(cè)hIL10-MSCs在蛛網(wǎng)膜下腔存活情況，腰段脊髓hIL10蛋白及脊髓膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、OX-42、IL-1β、IL-6和TNFα表達(dá)情況。 結(jié)果與對(duì)照組和空載體-rMSCs組相比，hIL10-MSCs組鞘內(nèi)注射后3、7、14天PWT及PWL均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，而空載體-MSCs組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；hIL10-MSCs組和空載體-MSCs組鞘內(nèi)注射細(xì)胞7、14天后在

9、熒光激發(fā)下可見綠色熒光細(xì)胞，而對(duì)照組則未見綠色熒光細(xì)胞：對(duì)照組、空載體-MSCs組各時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到人白介素10蛋白表達(dá)，hIL10-MSCs組腰段脊髓組織人白介素10含量在鞘內(nèi)注射細(xì)胞后3、7、14天分別為1.24±0.25ng/mg.2.24±0.30 ng/mg、1.82±0.29 ng/mg。與對(duì)照組及空載體-MSCs組相比，hIL10-MSCs組腰段脊髓膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、OX-42表達(dá)明顯降低，IL-1β、IL-6和TNFα表