ERC(N5)小肽對人臍靜脈內皮細胞系HUVEC增殖、侵襲作用的研究.pdf

1、目的:
　　 1、分析ERC(N5)與人臍靜脈內皮細胞HUVEe結合的情況
　　 2、觀察ERC(N5)對HUVEC細胞凋亡及侵襲作用的影響
　　 方法:
　　 1、ERC(N5)小肽的設計與合成
　　 將蛇毒鋸鱗蝰素( Echistatin，Ech)氨基酸序列中的RGD模體及其周邊序列直接與C末端序列結合，突變第五個氨基酸(D—N)并適當減少氨基酸的數(shù)目，設計成含16個氨基酸的小肽，其序列為AR

2、GDNMPRNPHKGPAT，命名為ERC(N5)，由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成。
　　 2、ERC(N5)與人臍靜脈內皮細胞HUVEC的結合情況分析
　　 利用流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測人臍靜脈內皮細胞表面αvβ3的表達情況；分別將ERC(N5)、Ech、FITC-LM609(整合素αvβ3的單克隆抗體)與HUVEC細胞共同孵育后，流式細胞術檢測FITC標記的陽性細胞率，分析ERC(N5)

3、/Ech與抗體競爭結合αvβ3的情況。
　　 3、ERC(N5)對HUVEC細胞凋亡、侵襲作用的研究
　　 置顯微鏡觀察ERC(N5)處理后的HUVEC形態(tài)變化；通過AO/EB對細胞核染色觀察細胞形態(tài)的變化；Annexin V-FITC/PI雙染法結合流式細胞儀檢測ERC(N5)對HUVEC凋亡率的影響；用RT-PCR檢測細胞凋亡基因Caspase-3表達。利用細胞劃痕愈合實驗、Transwell遷移實驗和Matrige

4、l侵襲實驗觀察ERC(N5)對HUVEC遷移、侵襲能力的影響。
　　 結果:
　　 1、人臍靜脈內皮細胞HUVEC細胞表面整合素αvβ3表達量為68.3％。
　　 2、ERC(N5)、FITC-LM609與HUVEC細胞共孵育后，F(xiàn)ITC標記的陽性細胞率隨著ERC(N5)濃度的增大而逐漸減小。終濃度為16μM的ERC(N5)與Ech分別與HUVEC孵育后，其αvβ3陽性細胞率分別為l.2％和26.8％。
　

5、　 3、HUVEC經(jīng)ERC(N5)作用24h后，細胞變圓、間隙增大、有細胞碎片出現(xiàn)。經(jīng)AO/EB染色后，出現(xiàn)核染色質著綠色呈固縮狀的早期凋亡細胞和核染色質為橘紅色的晚期凋亡細胞。細胞凋亡率檢測結果顯示，ERC(N5)作用HUVEC細胞后，凋亡率增加5倍。
　　 4、RT-PCR結果顯示在經(jīng)ERC(N5)處理后Caspase-3基因表達較對照組明顯增加，且有劑量依賴關系。
　　 5、ERC(N5)作用下，HUVEC細胞的