Tmub1在IL-6誘導(dǎo)的肝細胞增殖過程中的作用及其表達調(diào)控的研究.pdf

1、研究背景：
　　 肝功能衰竭是各類肝臟疾病的終末期狀態(tài)，常見而又難以得到有效治療。我們知道，肝臟切除過多會導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭，這就大大限制了肝臟外科手術(shù)的開展。由于肝臟功能的復(fù)雜性，人工肝技術(shù)并不能完全替代肝臟功能，而且其遠期療效難以令人滿意；肝臟移植由于供體數(shù)量、免疫排斥、治療費用等原因，也不能廣泛開展。所以，有效刺激自身肝再生則是解決這些問題的理想途徑。正常成體的肝細胞為穩(wěn)定細胞，極少發(fā)生有絲分裂，但在受到損傷和其他因素刺激

2、時殘余肝細胞會迅速出現(xiàn)活躍的分裂增殖，并呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，這就告訴我們：如果能夠合理刺激肝病患者自身肝臟的再生，則可彌補生物人工肝和肝移植技術(shù)的不足，有效解決肝功能衰竭。國內(nèi)外也積極開展了針對肝臟再生的很多研究，由于其機制迄今還不完全清楚，進展并不理想。
　　 Tmub1(transmemebrane and ubiquitin-like domain containing1)是2005年首次被Fazia等報道的新分子，在肝細胞

3、增殖過程中發(fā)揮重要作用，Tmub1在肝再生過程中表達明顯升高，而且過表達的Tmub1對細胞增殖起抑制作用[1]。本課題組對大鼠肝部分切除后基因表達譜進行分析時，也發(fā)現(xiàn)肝部分切除后大鼠的Tmub1基因表達明顯上調(diào)。同時還發(fā)現(xiàn)Tmub1可在一定程度上STAT3表達及活化，提示Tmub1在肝細胞增殖過程中可能發(fā)揮負反饋調(diào)控作用，但其具體的作用機制還有待深入研究。鈣離子信號調(diào)節(jié)親環(huán)素配體(Calcium modulating cyclophil

4、in ligand，CAML)在所有組織中都有表達，在細胞增殖、凋亡和功能中發(fā)揮重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)CAML是Tmub1的靶蛋白，但沒有對其具體的作用機制進行闡述，更沒有對肝再生將產(chǎn)生怎樣的影響開展研究。在肝細胞增殖再生過程中，如果Tmub1和CAML能發(fā)生相互作用，將可能對肝細胞增殖產(chǎn)生影響，這可能是Tmub1調(diào)控肝細胞增殖的機制之一。IL-6是肝細胞增殖啟動信號中非常重要的組成部分，對多種增殖特異性基因的表達發(fā)揮直接或間接的調(diào)控

5、作用。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)IL-6能上調(diào)Tmub1的表達，提示Tmub1的表達調(diào)控和IL-6信號通路有關(guān)。因此明確IL-6及其下游分子與Tmub1表達之間的關(guān)系，對闡明Tmub1基因表達調(diào)控機制具有重要意義。如果有機會探明Tmub1的分子特征及其表達調(diào)控機制，將為從新的角度探討肝再生及肝細胞增殖過程的分子調(diào)控機制提供新的依據(jù)，具有重要的臨床意義。
　　 研究目的：
　　 1.明確Tmub1對肝細胞增殖能力的影響，尤其是明確

6、Tmub1在IL-6誘導(dǎo)的肝細胞增殖中的作用。
　　 2.明確增殖的肝細胞中是否存在Tmub1和CAML的相互作用，并了解其可能的作用機制。
　　 3.了解IL-6調(diào)控Tmub1基因表達的可能機制，明確可能參與Tmub1轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 4.明確IL-6下游轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與Tmub1表達之間的關(guān)系。
　　 材料方法：
　　 1.采用Tmub1基因shRNA慢病毒載體抑制大鼠肝細胞中Tm

7、ub1的表達，并使用IL-6誘導(dǎo)肝細胞增殖，采用[3H]-TdR摻入實驗檢測肝細胞增殖能力變化，采用RT-PCR、Western-blot技術(shù)檢測Tmub1基因表達的情況。
　　 2.采用免疫共沉淀、激光共聚焦實驗驗證大鼠肝細胞內(nèi)是否存在Tmub1和CAML的相互作用，同時在抑制Tmub1表達的情況下檢測Tmub1對肝細胞中CAML蛋白含量及鈣離子內(nèi)流的影響。
　　 3.采用啟動子在線分析軟件分析Tmub1基因5’端上游

8、序列，尋找和肝再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點。
　　 5.根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，構(gòu)建一系列Tmub1基因5’端上游序列的螢光素酶報告基因載體，將所構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染入肝細胞，檢測各刪除序列的啟動子活性，同時檢測IL-6對Tmub1啟動子活性的影響。
　　 6.合成大鼠C/EBPβ的siRNA并轉(zhuǎn)染入BRL-3A細胞，在抑制C/EBPβ表達的條件下，觀察C/EBPβ對Tmub1表達的影響。
　　 7.構(gòu)建C/EBPβ

9、過表達載體，將C/EBPβ過表達載體和Tmub1螢光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染入BRL-3A細胞，并觀察C/EBPβ對Tmub1基因基因5’端上游序列轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有Tmub1 shRNA慢病毒載體的細胞系
　　 通過流式細胞儀篩選獲得轉(zhuǎn)染有Tmub1 shRNA慢病毒載體的細胞系命名為BRL-3A/256，轉(zhuǎn)染空載體的細胞作為陰性對照(命名為BRL-3A/Neg)，BRL-

10、3A/256細胞系中Tmub1表達被有效抑制。
　　 2.明確了IL-6體外誘導(dǎo)肝細胞增殖的最佳使用條件
　　 在IL-6的工作濃度為15ng/ml，誘導(dǎo)時間為12h的情況下，BRL-3A的[3H]-Tdr摻入率達到最高，在后續(xù)的試驗中都采用該條件使用IL-6。
　　 3.IL-6能明顯上調(diào)大鼠肝細胞內(nèi)Tmub1的表達
　　 在IL-6誘導(dǎo)肝細胞增殖的過程中，IL-6能使大鼠肝細胞中Tmub1的mRNA和

11、蛋白水平都顯著升高(p<0.05)，而且IL-6誘導(dǎo)能夠部分逆轉(zhuǎn)shRNA慢病毒載體對Tmub1表達的抑制作用(p<0.05)。
　　 4.抑制Tmub1表達對肝細胞增殖有促進作用
　　 在不使用重組IL-6對細胞進行處理的條件下，抑制Tmub1表達可使BRL-3A/256細胞的[3H]-TdR摻入率明顯高于BRL-3A和BRL-3A/Neg組細胞(P<0.05)；加入IL-6誘導(dǎo)后這種現(xiàn)象仍然存在，而且這種差異更加明顯

12、(P<0.05)。
　　 5.大鼠肝細胞內(nèi)存在Tmub1和CAML的相互作用
　　 激光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)鼠肝細胞內(nèi)Tmub1和CAML蛋白均有表達，共定位于肝細胞漿中；免疫共沉淀實驗證實，Tmub1和CAML能在肝細胞中發(fā)生結(jié)合；抑制Tmub1表達可使大鼠肝細胞內(nèi)CAML蛋白含量增加，同時肝細胞鈣離子內(nèi)流也增強。
　　 6.Tmub1基因5’端上游序列中存在多個肝再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子潛在結(jié)合位點
　　 Tmub

13、1基因5’端上游-2007～+50之間序列中存在多個和肝再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子潛在結(jié)合位點，包括5個C/EBP結(jié)合位點、3個AP-1結(jié)合位點、1個STAT結(jié)合位點、2個CREB結(jié)合位點。
　　 7.獲得了大鼠Tmub1基因5’端上游基因刪除片段螢光素酶報告基因載體
　　 構(gòu)建了含-2008～+50、-1734～+50、-1637～+50、-1559～+50、-1392～+50、-1267～+50、-876～+50、-679～

14、+50、-467～+50、-273～+50、-152～+50、-57～+50等12個刪除片段的螢光素酶報告基因載體(分別命名為T1-T12)，各載體經(jīng)MluI和XhoI雙酶切、PCR擴增并測序鑒定后確定載體構(gòu)建正確。
　　 8.Tmub15’端上游-2008～+50序列有明顯的轉(zhuǎn)錄活性
　　 所構(gòu)建的報告基因載體的螢光素活性均明顯高于對照組(P<0.05)，提示-2008～+50序列有明顯的轉(zhuǎn)錄活性。其中除托T4、T6載

15、體外，其余各刪除序列轉(zhuǎn)錄活性總體呈依次下降趨勢。
　　 9.IL-6能明顯增強Tmub1基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性
　　 加入IL-6的誘導(dǎo)后，除轉(zhuǎn)染T5、T6載體的細胞外外，其余各組細胞的螢光素酶活性都顯著升高(P<0.05)，提示IL-6能增強Tmub1基因轉(zhuǎn)錄。根據(jù)各實驗組細胞螢光素酶差異情況分析，刪除C/EBPβ、STAT3、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點所在的序列可使Tmub1啟動子區(qū)序列的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降。
　

16、　 10.大鼠肝細胞內(nèi)C/EBPβ和Tmub1表達正相關(guān)
　　 采用siRNA抑制BRL-3A內(nèi)C/EBPβ表達后，Tmub1的表達水平也明顯下降(p<0.05)，提示C/EBPβ和Tmub1的表達正相關(guān)。
　　 11.構(gòu)建了C/EBPβ過表達載體
　　 在pCMVTag2B載體中插入大鼠C/EBPβ全表達序列，獲得載體經(jīng)BamHIU和XhoI雙酶切、PCR擴增并測序鑒定后確定載體構(gòu)建正確，并命名為pCMVTa

17、g2B-C/EBP。
　　 12.C/EBPβ能顯著增強Tmub1基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性
　　 將pCMVTag2B-C/EBP載體與Tmub1基因螢光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染入BRL-3A細胞后，除轉(zhuǎn)染T6載體的細胞外外，其余各組細胞的螢光素酶活性都明顯增加，說明C/EBPβ能顯著增加Tmub1基因的轉(zhuǎn)錄。T2較T1，T11較T10，T12較T11載體螢光素酶活性下降幅度最大，提示C/EBPβ增強Tmub1基因轉(zhuǎn)錄可能和

18、-2008～-1735、-273～-153及-152～-58序列有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Tmub1可抑制大鼠肝細胞增殖，在肝再生過程中可能發(fā)揮負向調(diào)控作用。
　　 2.增殖的肝細胞中存在Tmub1和CAML的相互作用，Tmub1可能通過參與CAML蛋白的降解并影響鈣離子內(nèi)流來抑制肝細胞增殖。
　　 3.IL-6可能通過激活C/EBPβ、STAT3、AP-1等下游轉(zhuǎn)錄因子來增強Tmub1的表達。