重組人sTRAIL和IL-6在煙草中的表達研究.pdf

1、植物生物反應器，又稱“分子農(nóng)場”，是當今植物基因工程研究的熱點領域。應用植物生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白具有成本低、易于儲存和運輸、無對人有害的病原體污染等優(yōu)勢。
　　 傳統(tǒng)的核轉(zhuǎn)化技術已被廣泛地應用于藥用蛋白的生產(chǎn)。外源蛋白通過核轉(zhuǎn)化可以在胞質(zhì)中積累，或與定位信號肽融合后在葉綠體中積累。隨著葉綠體轉(zhuǎn)化技術的發(fā)展和改進，“分子農(nóng)場”更加引入注目，同時具有了更廣闊的應用前景。葉綠體轉(zhuǎn)化較傳統(tǒng)的核轉(zhuǎn)化有很多優(yōu)勢，如很高的外源蛋白表達量、無

2、位置效應和基因沉默現(xiàn)象、可用多順反子方式表達多個基因、高生物安全性等。
　　 本研究首次將兩種藥用蛋白TRAIL（腫瘤壞死因子相關凋亡配體）和IL-6(白細胞介素-6)分別在煙草中表達。
　　 TRAIL蛋白是腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TNF)家族的成員，TRAIL與其可溶性部分(sTRAIL)均可選擇性誘導腫瘤細胞的凋亡，而對正常的細胞沒有顯著影響。因此它們都是很有潛力的抗癌藥物。目前TRAIL作為抗癌治療蛋白已經(jīng)進入

3、臨床Ⅱ期的研究。
　　 本研究首先將sTRAIL的編碼序列轉(zhuǎn)化到核基因組和葉綠體基因組中。在核轉(zhuǎn)化中，通過構建不含和含有來自豌豆Rubiseo小亞基的葉綠體定位信號序列的轉(zhuǎn)化載體，使sTRAIL能夠分別在胞質(zhì)和葉綠體中積累。通過PCR和Southern反應，鑒定了兩個葉綠體轉(zhuǎn)化的煙草株系(T3和T8)。RT-PCR結果顯示，這兩個株系中的$TRAIL的mRNA正常轉(zhuǎn)錄。經(jīng)過Western雜交鑒定，在這兩個株系的生長初期，都檢測到

4、了sTRAIL蛋白的積累。但是隨著繼代培養(yǎng)的進行，sTRAIL的積累水平在兩個株系間差異很大。通過ELISA試驗對這兩個株系的sTRAIL表達水平進行定量，結果顯示sTRAIL在轉(zhuǎn)化株糸T3中約占可溶性總蛋白的0.9％。實驗中也獲得了一些核轉(zhuǎn)化的煙草株系，分別為葉綠體定位表達株系和胞質(zhì)表達株系。所有這些株系都可以正常轉(zhuǎn)錄sTRA兒的mRNA。雖然部分葉綠體定位表達sTRAIL蛋白的株系可以檢測到該蛋白的積累，但是其積累水平僅為葉綠體轉(zhuǎn)基

5、因株系的1/40。而沒有進行定位表達的核轉(zhuǎn)化株系外源蛋白的積累量則更低。
　　 IL-6是一種多效的細胞因子，具有很多生理功能，如刺激細胞生長、促進細胞分化、恢復輻射致?lián)p的造血和免疫功能。IL-6在機體的免疫調(diào)節(jié)、免疫應答、炎癥反應、造血調(diào)控和一些疾病的發(fā)生過程中起了關鍵性的作用。由于傳統(tǒng)的直接提取法制備價格昂貴、產(chǎn)量較低，嚴重阻礙了IL-6的相關研究和應用。本研究中將人IL-6蛋白在煙草的葉綠體中進行了表達，獲得了兩個葉綠體轉(zhuǎn)

6、化株系。然而盡管可以通過RT-PCR檢測到兩個株系中1L-6基因的轉(zhuǎn)錄，但在Western檢測中卻沒有發(fā)現(xiàn)其蛋白的積累。IL-6在大腸桿菌中的表達實驗也非常困難。IL-6在原核起源的葉綠體中的低表達水平可能是由于其部分密碼子在原核mRNA翻譯系統(tǒng)中是稀有密碼子。．在葉綠體轉(zhuǎn)化的煙草株系中，由于外源基因的插入，發(fā)生了葉綠體基因組上的非預期重組現(xiàn)象。葉綠體基因組的重組參與了葉綠體基因組DNA的復制、修復等途徑，在維持葉綠體基因組DNA的穩(wěn)定

7、過程中起著重要的作用。本研究中共發(fā)現(xiàn)了三種非預期的重組現(xiàn)象，并通過PCR、反向PCR及鳥槍法克隆技術，確定了可通過同向重復誘發(fā)重組的熱點序列，分別為395 bp的psbA基因3’UTR序列，23 bp的I6S rrn基因啟動子的下游序列，15bp，rbcL基因的5'UTR序列。經(jīng)驗證，395bp的psbA基因3'UTR同向重復引發(fā)的重組導致了編碼光系統(tǒng)II的核心蛋白D1蛋白的psbA基因由葉綠體基因組環(huán)化脫落，從而導致了黃化及斑葉兩種異