趨化素樣細(xì)胞因子1（CKLF1）C端肽C19、C27干預(yù)對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥、黏液分泌及氣道反應(yīng)性的影響.pdf

1、研究背景:支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病.20世紀(jì)80年代后提出了哮喘的本質(zhì)是氣道慢性炎癥和氣道高反應(yīng)性(AHR).氣道炎癥是氣道高反應(yīng)性(AHR)的病理基礎(chǔ),黏液高分泌、氣道高反應(yīng)性、可逆性氣流受限和氣道重構(gòu)是哮喘的重要特征,其中嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)在哮喘的發(fā)病中起了重要的作用,嗜酸性粒細(xì)胞在氣道局部的浸潤(rùn)是哮喘的最顯著的特征之

2、一,研究認(rèn)為肺部EOS浸潤(rùn)是氣道高反應(yīng)性(AHR)發(fā)生的必要條件. 趨化素樣因子1(CKLF1),為一新基因超家族的趨化因子,是北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系馬大龍教授領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室在國(guó)際上首先發(fā)現(xiàn)并成功克隆的一個(gè)新的具有趨化活性的細(xì)胞因子,獲中國(guó)及國(guó)際專(zhuān)利,并命名為趨化素樣因子1.CKLF1是一種分泌性蛋白,對(duì)CKLF1的體內(nèi)外功能研究發(fā)現(xiàn),大鼠CKLF1和人CKLF1相似,對(duì)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等具有明顯的趨化活性,并具有刺激骨骼肌

3、增殖活性和刺激骨髓細(xì)胞增殖活性,并且能與人CCR4結(jié)合,證實(shí)CKLF1是CCR4又一新的功能配體.CKLF1在活化的CD4<'+>/CD8<'+>T細(xì)胞表達(dá)上調(diào).在注射CKLF1真核表達(dá)質(zhì)粒的小鼠肺部炎性病變明顯,與哮喘發(fā)病的病理改變非常相似,且正常人氣道上皮細(xì)胞可表達(dá)CKLF1mRNA,其可因TNF-a的刺激而加強(qiáng),肺組織的Western blot及免疫組化結(jié)果顯示CKLF1基因在肺內(nèi)表達(dá)顯著.對(duì)進(jìn)一步利用化學(xué)合成的CKLF1 C端肽

4、C19、C27的體外功能研究,發(fā)現(xiàn)其對(duì)CCR4、CCR5轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有趨化作用,C19趨化活性較弱.CKLF1具有的炎細(xì)胞趨化活性及獨(dú)特的致肺部病理改變等特征,CKLF1是否參與哮喘氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性(AHR)的發(fā)生發(fā)展?由此本研究選擇CKLF1的C端肽C19、C27在哮喘小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)功能的研究,觀察其對(duì)哮喘小鼠氣道EOS炎癥、氣道黏液分泌及對(duì)氣道反應(yīng)性的影響. 研究目的:在成熟的哮喘模型基礎(chǔ)上,腹腔注射CKLF1的C端肽

5、C19、C27,觀察其對(duì)哮喘小鼠氣道EOS炎癥、氣道黏液分泌及對(duì)氣道反應(yīng)性的影響. 研究方法:選擇健康雄性的C57BL/6小鼠,6-8周齡,體重18-22g.以卵白蛋白(OVA)作為抗原進(jìn)行兩次腹腔注射致敏和三次霧化吸入激發(fā),建立哮喘模型,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(以生理鹽水(NS)代替OVA).分別于激發(fā)前30min腹腔注射C19、C27不同劑量干預(yù),分為:陰性對(duì)照組(NS組)、致敏攻擊組(OVA組)、C19、C27不同劑量干預(yù)組.

6、于最后一次抗原激發(fā)后24h檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞,組織病理觀察肺組織炎癥和氣道黏液分泌,并檢測(cè)各組小鼠的氣道反應(yīng)性水平.分別以杯狀細(xì)胞化生指數(shù)--指每mm長(zhǎng)氣管上皮中杯狀細(xì)胞數(shù)目;上皮黏液儲(chǔ)備指數(shù)--上皮過(guò)碘酸-雪呋(PAS)陽(yáng)性染色面積比氣管上皮總面積,作為氣道黏液的定量觀察指標(biāo).行肺組織病理切片觀察嗜酸性粒細(xì)胞和其它炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn). 研究結(jié)果: 1.C19、C27干預(yù)對(duì)哮喘小鼠BALF中Eos數(shù)的

7、影響在OVA致敏攻擊組,BALF中Eos數(shù)較陰性對(duì)照組明顯增高.C19、C27干預(yù)后,與OVA致敏攻擊組比較,C19各劑量組Eos比例和Eos絕對(duì)數(shù)均有顯著性差異,但C19各劑量組間無(wú)顯著性差異;C27各劑量組Eos比例和Eos絕對(duì)數(shù)無(wú)顯著性差異. 2.C19、C27干預(yù)對(duì)哮喘小鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)的影響肺組織病理切片HE染色顯示:陰性對(duì)照組小鼠氣道及血管周?chē)鸁o(wú)Eos浸潤(rùn),上皮完整;而OVA致敏攻擊組小鼠氣道及血管周?chē)梢?jiàn)大量炎癥

8、細(xì)胞和Eos浸潤(rùn),并波及肺實(shí)質(zhì),上皮脫落不完整.C19干預(yù)顯示各劑量組氣道及血管周?chē)钥梢?jiàn)一些炎癥細(xì)胞,但Eos較OVA致敏攻擊組明顯降低,上皮基本完整.C27干預(yù)后較OVA致敏攻擊組無(wú)明顯改變.PAS染色顯示:陰性對(duì)照組氣道未見(jiàn)GC增生和肥大,未見(jiàn)氣道上皮細(xì)胞黏液分泌;OVA致敏攻擊組可見(jiàn)氣道上皮杯狀細(xì)胞增生肥大,并有大量黏液分泌;C19、C27干預(yù)后鏡下各組較OVA致敏攻擊組無(wú)明顯差異改變. 3.C19、C27干預(yù)對(duì)哮喘小鼠

9、氣道黏液的定量分析OVA致敏攻擊組和C19、C27干預(yù)組氣道黏液的儲(chǔ)備指數(shù)和杯狀細(xì)胞的化生指數(shù)均高于陰性對(duì)照組,C19、C27干預(yù)各劑量組與OVA致敏攻擊組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 4.C19、C27干預(yù)對(duì)哮喘小鼠氣道反應(yīng)性的影響C19各干預(yù)組胸腔壓(Ppl)與OVA致敏攻擊組比較顯著降低,但C19各劑量組之間胸腔壓差異無(wú)顯著性;C27各干預(yù)組Ppl與OVA致敏攻擊組比較并無(wú)顯著性差異. 結(jié)論: 1.CKLFl C