重組HPV16 E7，11E7，6E7蛋白的克隆、表達(dá)、純化及理化性質(zhì)的檢測(cè).pdf

1、目的:構(gòu)建PET30a(+)HPV16 E7，PET30a(+)HPV6 E7，PET30a(+)HPV11 E7的原核表達(dá)載體，并對(duì)PET30a(+)HPV16 E7進(jìn)行表達(dá)純化及理化性質(zhì)的檢測(cè)。為HPV體外檢測(cè)試劑的研制提供相應(yīng)的技術(shù)平臺(tái)。 方法:收集人病變子宮頸組織標(biāo)本，提取基因組，根據(jù)已知的基因序列設(shè)計(jì)引物，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增從中篩選出16型、6型和11型HPV陽性的標(biāo)本。回收HPV16 E7，HPV6E7,HPV11 E

2、7的基因片段。構(gòu)建PET30a(+)HPV16 E7，PET30a(+)HPV6 E7，PET30a(+)HPV11 E7的原核表達(dá)重組質(zhì)粒。用PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和核酸序列測(cè)定對(duì)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定，將序列正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入工程菌E. coli BL21(DE 3)進(jìn)行誘導(dǎo)以表達(dá)相應(yīng)蛋白。通過調(diào)節(jié)IPTG誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間以優(yōu)化表達(dá)條件。使用AKTK純化設(shè)備，通過硫酸銨沉淀、陰離子交換和帶組氨酸標(biāo)記的親和層析等方法對(duì)重組蛋

3、白HPV16E7進(jìn)行了純化、回收重組HPV16 E7蛋白。Lowry法測(cè)定重組融合蛋白的濃度。用紫外分光光度計(jì)對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。SDS-PAGE電泳及Westem blot檢測(cè)鑒定表達(dá)蛋白的分子量及特異性。 結(jié)果: PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和核酸序列檢測(cè)證實(shí)重組質(zhì)粒中插入的目的基因，其DNA大小、方向、插入位點(diǎn)和閱讀框架均正確；HPV16 E7，HPV6E7蛋白得到高效原核表達(dá)，其中HPV16 E7在37℃，0.

4、8mM IPTG的條件下主要以胞內(nèi)可溶性表達(dá)。通過硫酸銨沉淀、陰離子交換和組氨酸標(biāo)記的親和層析等方法對(duì)重組蛋白HPV16E7進(jìn)行了純化，得到純化的目的蛋白。理化特性的研究結(jié)果顯示：帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的HPV16 E7蛋白的表觀分子量大小為20KD，紫外吸收掃描圖譜顯示在280nm處有最大吸收峰。Lowry法測(cè)定純化后的含his標(biāo)簽的HPV16E7重組蛋白濃度為0.89mg/ml。經(jīng)Westem Blot檢測(cè)表明HPV16 E7蛋白有良好