PTEN在擬阿爾茨海默病樣細(xì)胞模型發(fā)生中的變化及作用.pdf

1、阿爾茨海默病(AD)，是與年齡高度相關(guān)的原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病，以神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)形成和老年斑(SP)為主要病理特征。AD的病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚不清楚，臨床上也缺乏根本有效的治療手段，因此有關(guān)AD發(fā)病機(jī)制的探索以及新的藥物作用靶點(diǎn)或有效的干預(yù)環(huán)節(jié)的尋找，是當(dāng)今AD研究的熱點(diǎn)。 PTEN屬蛋白酪氨酸磷酸酶，具有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)雙重特異性磷酸酶活性，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)分子，它與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡調(diào)控等方面都有密切的關(guān)系。隨著近年

2、來(lái)人們對(duì)PTEN認(rèn)識(shí)的不斷增加，PTEN在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用也日益受到重視。但是，PTEN與AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)及其意義有待于探索。
　　 本研究探索了PTEN在擬AD樣細(xì)胞模型發(fā)生發(fā)展中的變化狀況。首次觀察到，在岡田酸(Okadaic acid，OA)誘導(dǎo)的擬AD樣細(xì)胞模型的發(fā)生發(fā)展中，PTEN蛋白水平呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，即隨著細(xì)胞損傷程度的加重和磷酸化tau蛋白水平的改變，PTEN蛋白水平表現(xiàn)

3、出先升高后下降的現(xiàn)象，提示PTEN可能在AD的發(fā)病機(jī)制中起著一定的作用。在此基礎(chǔ)上，本課題首先在4個(gè)不同誘導(dǎo)因素誘導(dǎo)建立的擬AD樣細(xì)胞模型中，通過(guò)觀察PTEN蛋白水平、PTENmRNA的動(dòng)態(tài)變化以進(jìn)一步明確PTEN在AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律；進(jìn)而采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)阻斷PTEN基因表達(dá)，分析其對(duì)岡田酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞擬AD樣細(xì)胞模型發(fā)生中細(xì)胞損傷和tau(Ser396)蛋白過(guò)度磷酸化的影響，探索下調(diào)PTEN基因表達(dá)

4、在AD樣細(xì)胞模型發(fā)生中的作用；進(jìn)而探索其作用的可能分子機(jī)制，以期深化理解AD的發(fā)病機(jī)制，為AD防治的新途徑和抗AD新的藥物靶點(diǎn)的研發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)主要研究?jī)?nèi)容包括以下兩個(gè)部分：
　　 ㈠PTEN在擬阿爾茨海默病樣細(xì)胞模型發(fā)生發(fā)展中的變化。
　　 分別以O(shè)A和β淀粉樣蛋白多肽25-35(β-amyloid peptide25-35，Aβ25-35)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞或SD大鼠胎鼠的皮層神經(jīng)元原代細(xì)胞，建立擬

5、AD樣細(xì)胞模型，以細(xì)胞形態(tài)、磷酸化tau蛋白水平的變化作為反映細(xì)胞AD樣指標(biāo)，探討AD樣細(xì)胞模型誘導(dǎo)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中PTEN蛋白水平、PTEN mRNA水平的變化規(guī)律，并分析其與細(xì)胞AD樣發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，在4個(gè)AD樣實(shí)驗(yàn)性細(xì)胞模型中均觀察到OA或Aβ25-35所致的細(xì)胞皺縮、突起中斷等細(xì)胞進(jìn)行性損傷的形態(tài)學(xué)變化，磷酸化tau蛋白[p-tau(Ser396)]水平均呈現(xiàn)先緩慢升高后下降的變化，提示擬AD樣細(xì)胞模型建立成功；1)在4

6、0 nmol/L OA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的擬AD樣細(xì)胞模型中，給予OA后3 h PTEN蛋白水平開(kāi)始升高，6 h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，48 h時(shí)PTEN蛋白水平低于0 h，但無(wú)顯著性差異；PTENmRNA表達(dá)水平也表現(xiàn)為升高，6 h即明顯升高，24 h達(dá)高峰，隨后略有下降，但至48 h仍明顯高于0 h(P＜0.01)。2)40μmol/L Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞時(shí)，PTEN蛋白水平3 h開(kāi)始升高，12 h達(dá)高峰后逐漸

7、下降，48 h時(shí)接近0 h值；PTEN mRNA表達(dá)水平6 h時(shí)下降，隨后升高，12 h達(dá)高峰后略有下降，但48 h時(shí)仍高于0 h值(P＜0.01)。3)20 nmol/L OA誘導(dǎo)大鼠胎鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞，PTEN蛋白水平3 h開(kāi)始升高，12 h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，48 h時(shí)PTEN蛋白水平明顯低于0 h(P＜0.01)。4)20μmol/L Aβ25-35誘導(dǎo)大鼠胎鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞，Aβ25-35誘導(dǎo)后PTEN蛋白水平升高，6 h

8、達(dá)到高峰隨后下降，24 h的PTEN水平低于0 h(P＜0.01)。上述結(jié)果提示，在4個(gè)AD樣細(xì)胞模型發(fā)生發(fā)展中，PTEN表達(dá)均呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的動(dòng)態(tài)變化，且PTEN蛋白水平的升高先于磷酸化tau(Ser396)蛋白水平的升高，提示PTEN與AD的發(fā)生發(fā)展可能具有一定的關(guān)聯(lián)性，AD發(fā)生早期PTEN表達(dá)可能增強(qiáng)。
　　 ㈡下調(diào)PTEN基因表達(dá)對(duì)OA所致SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白異常磷酸化的影響及可能的分子機(jī)制。
　　 針

9、對(duì)人PTEN基因的RNA干擾慢病毒顆粒和攜帶GFP的陰性慢病毒顆粒感染SH-SY5Y細(xì)胞，通過(guò)westem-blot法和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)鑒定PTEN基因的干擾效率約達(dá)到86.7％。采用40 nmol/L OA誘導(dǎo)細(xì)胞24 h建立擬AD樣細(xì)胞模型，與未感染組細(xì)胞和感染陰性病毒載體的細(xì)胞相比，下調(diào)PTEN基因表達(dá)的細(xì)胞對(duì)于OA所致的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)改善，細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Ser396位點(diǎn)磷酸化tau蛋白的水平顯

10、著降低(P＜0.05)。接著通過(guò)觀察PI3K/Akt信號(hào)通路及其下游GSK-3β蛋白水平的變化對(duì)PTEN和Ser396位點(diǎn)磷酸化tau蛋白之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)下調(diào)了PTEN基因表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞在OA孵育24 h后，與陰性對(duì)照組相比其Akt的活化形式p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)水平增加，PI3K/Akt信號(hào)通路激活，進(jìn)而使p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平升高而抑制GSK-3β的活性，使磷酸化tau(Ser396)蛋白

11、水平降低。
　　 本研究表明：⑴在AD樣細(xì)胞模型發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，PTEN表達(dá)呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的動(dòng)態(tài)變化，且PTEN蛋白水平的升高先于磷酸化tau(Ser396)蛋白水平的升高，提示PTEN與AD發(fā)生發(fā)展可能具有一定的關(guān)聯(lián)性，AD發(fā)生早期PTEN表達(dá)可能增強(qiáng)。⑵慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾抑制PTEN基因表達(dá)可對(duì)抗OA誘導(dǎo)的tau(Ser396)蛋白異常磷酸化等AD樣變化，提示PTEN表達(dá)增強(qiáng)可能具有促進(jìn)AD發(fā)生的作用。⑶PTEN對(duì)OA