SDS-PAGE等三種方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌的比較鑒定及類毒素疫苗的初步研究.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的猝死癥，發(fā)病急，死亡快，因此，對疫區(qū)流行的產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素型及時準確地做出判斷是非常必要的。本研究詳細介紹了SDS-PAGE的檢測方法，并采用該方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株、德國牛舍環(huán)境氣源性產(chǎn)氣莢膜梭菌20株分離株和山東省部分地區(qū)分離到的57株產(chǎn)氣莢膜梭菌進行毒素型的鑒定，并對不同檢測方法的鑒定結(jié)果進行了比較，結(jié)果SDS-PAGE與ELISA的符合率為95％，與多重PCR的符合率為100％。與此同時，SDS-PAGE

2、方法鑒定的過程中提取了大量的外毒素，滅活后制備類毒素疫苗有針對性控制該病的流行和發(fā)生。另外，對產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素的致病性也進行了初步研究。 本研究共分為五個部分： 第一部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離和初步鑒定對山東省不同地區(qū)采集的樣品通過純分離培養(yǎng)，需氧及厭氧環(huán)境的對照培養(yǎng)，形態(tài)觀察，API-20A系統(tǒng)生化試驗，牛乳爆裂發(fā)酵試驗，毒素檢查對采集樣品進行了分離和初步鑒定。結(jié)果，從298個樣品中最終分離出57株產(chǎn)氣莢膜梭菌。

3、 第二部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素純化過程中硫酸銨沉淀法的改進本試驗采用不同飽和度的硫酸銨對產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素蛋白進行鹽析，并對粗提的蛋白進行電泳，通過電泳后的毒素蛋白條帶及蛋白含量，最終確定60％飽和度的硫酸銨可以有效的沉淀產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素蛋白。 第三部分：SDS-PAGE方法鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株NTCC Type B 6121，德國牛舍環(huán)境氣源性產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株20株和實驗一分離的57株產(chǎn)氣莢膜梭菌除

4、菌后，分別以60％和40％飽和度的硫酸銨溶液進行兩次鹽析。所得沉淀溶解后先經(jīng)透析脫鹽處理，再經(jīng)SephadexG-200層析，并通過瓊脂擴散試驗檢測層析液的毒素免疫活性。將含有毒素活性的層析液合并濃縮后即得到較純的毒素。結(jié)果，經(jīng)SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定出德國牛舍環(huán)境氣源性產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株20株中A型16株、C型3株和D型1株；山東地區(qū)分離株57株均為A型。 第四部分：Multi-PCR和ELISA對產(chǎn)

5、氣莢膜梭菌毒素型別的檢測通過分別采用ELISA、多重PCR和SDS-PAGE方法對德國牛舍氣源性產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株和山東省分離株進行型別研究，比較鑒定的結(jié)果，SDS-PAGE和ELISA方法檢測結(jié)果的符合率為95％，與多重PCR方法檢測結(jié)果的符合率為100％。結(jié)果表明SDS-PAGE方法與ELISA方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測結(jié)果有一定的差異性，與多重PCR方法的檢測結(jié)果一致。第五部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備及外毒素致病性的研究產(chǎn)氣莢

6、膜梭菌標準株和分離株接種營養(yǎng)肉湯進行增菌培養(yǎng)，然后再接種Gordon湯，43℃厭氧振蕩培養(yǎng)6～7h。所得培養(yǎng)物經(jīng)低溫高速離心后，上清液即為產(chǎn)氣莢膜梭菌粗制外毒素。經(jīng)測定其對小白鼠的LD<,50>分別為0.00316和0.001。該外毒素用0.3％甲醛，分別滅活8h、16h、32h、64h、128h，加入鋁膠佐劑濃縮制得產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗。對該疫苗分別進行了安全性檢驗、免疫效力試驗。結(jié)果表明用0.3％甲醛滅活32h可將產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒