預(yù)測環(huán)境因子潛在致癌性方法的探討.pdf

1、癌癥已是人類健康的最大威脅之一，盡管其發(fā)生、形成機(jī)理仍未被完全闡明，但大部分癌癥由環(huán)境因子引發(fā)已屬共識。某些環(huán)境因子引起細(xì)胞生長因子及其受體表達(dá)水平的改變，從而激發(fā)、增加DNA突變率并導(dǎo)致癌細(xì)胞的發(fā)生。因此，通過檢測環(huán)境因子對DNA突變率的激發(fā)結(jié)果來估計其誘發(fā)癌癥的可能性已成為一項重要的研究內(nèi)容。從數(shù)學(xué)分析方法上來看，它屬于統(tǒng)計推斷范疇，即由一系列實驗結(jié)果、數(shù)據(jù)來估計、推斷隨機(jī)事件發(fā)生的可能性；而正確的檢測、分析方法則是降低推斷分析中“

2、以真作假”和“以假作真”等錯誤機(jī)率的關(guān)鍵。 Ames測試是通過檢測化合物能否增加組氨酸缺陷型沙門氏菌的回復(fù)突變來推測其潛在致癌性，該測試對化合物的致突變性、潛在致癌性易于測試、判斷；但對于含組氨酸的復(fù)雜混合物，經(jīng)典的Ames測試并不適合，檢測、分析方法的不當(dāng)即會造成“以假作真”的錯誤推斷。近年來，在檢測中藥制劑的致突變性時，這一問題又恰恰發(fā)生了；當(dāng)然，這類問題同樣存在于用Ames測試來檢測其它復(fù)雜混合物的致突變性時。 不

3、久前，國家發(fā)展改革委發(fā)布了《高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化“十一五”規(guī)劃》，規(guī)劃提出在“十一五”期間我國將實施16個高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化重大專項，其中包括“現(xiàn)代中藥”重大專項。然而，能否準(zhǔn)確地檢測、評定中藥的致突變性、潛在致癌性會直接影響國家對中藥產(chǎn)業(yè)的政策，同時也關(guān)系到中藥能否被充分利用，更是關(guān)系到人類健康的頭等大事。因此，建立一個適于分析復(fù)雜混合物致突變性的方法就顯得尤為迫切和重要。 以表型為檢測指標(biāo)的突變檢測方法往往會受到多種因素的影響，同時環(huán)境因

4、子對DNA的致突變作用也絕不僅僅局限于某個特定的基因(如Ames測試中組氨酸操縱子的某個基因)，這涉及到隨機(jī)性還是特異性的問題，這一點在理論上至今還沒有確切的答案；而直接以DNA為檢測指標(biāo)的突變檢測方法應(yīng)是解決這類問題的關(guān)鍵所在。本論文的相關(guān)研究工作即在上述背景下展開，三年來取得了以下研究成果。 一、對影響Ames測試結(jié)果不確定性因素的分析 Ames測試是目前各個實驗室普遍采用的檢測環(huán)境來源的致突變物、潛在致癌物的通用初

5、篩方法之一，但該測試在實驗設(shè)計、實驗過程及實驗結(jié)果的分析上仍存在一些不確定性的因素和疑問。評估一個微生物群體的自發(fā)突變率和誘發(fā)突變率在遺傳理論和實驗技術(shù)上都是一個涉及多方面因素的復(fù)雜性難題，估計誘發(fā)突變率時涉及到對兩個正態(tài)分布的混合分布參數(shù)的估計，它需要大量的樣本，但Ames測試中樣本數(shù)均較小，無法用條件矩等方法估計混合分布的參數(shù)；DNA發(fā)生突變的隨機(jī)性和誘發(fā)因素的相關(guān)性也是尚未闡明的難題之一。 1.1 總體上來說，Ames測試

6、菌株只能檢測出導(dǎo)致小規(guī)模突變的致突變物和理化因子，對于更多其它類型的致突變物和理化因子則無法檢出，這就導(dǎo)致了該測試在有效檢出的致突變物類型及種類上存在較大的局限性，且易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 1.2 Ames測試菌株只能檢測出發(fā)生在特定位點上的突變，發(fā)生在其它位點上的突變則無法檢出。 1.3 Ames測試建立在營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基上，當(dāng)用其檢測復(fù)雜混合物如中藥的致突變性時，可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，適應(yīng)性突變更加劇了這種可能性。

7、 1.4 Ames測試中可統(tǒng)計的回復(fù)子菌落數(shù)是培養(yǎng)時間的函數(shù)，肉眼可見的回復(fù)子菌落數(shù)隨培養(yǎng)時間的延長而增多，人為規(guī)定的48h或其它時間是一個“約定俗成”的慣例，缺乏其應(yīng)具有的科學(xué)內(nèi)涵。 1.5 Ames測試中各類型的回復(fù)子在選擇培養(yǎng)基上的生長速率各不相同。在統(tǒng)計時，相當(dāng)數(shù)量的生長慢的回復(fù)子因未能形成肉眼可見的回復(fù)子菌落而不能被統(tǒng)計，這也是Ames測試這類基于試驗組與對照組間回復(fù)子菌落數(shù)差異的大小來判定物質(zhì)致突變性的檢測方法的致命

8、缺陷之一。 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使直接以DNA為檢測指標(biāo)的物質(zhì)致突變性檢測方法得以實現(xiàn)，其可避免Ames測試中較多不確定性因素和結(jié)果。 二、建立了一個檢測中藥制劑潛在致癌性的方法 Ames測試建立在含微量組氨酸的固體培養(yǎng)基上，要求試驗組與對照組中組氨酸含量相同，以使得試驗組與對照組中測試菌的分裂次數(shù)、生長量均趨于相同。該測試在檢測中藥致突變性時，因受中藥中組氨酸含量的影響，試驗組中組氨酸含量高于對照組而使對照組失

9、去了可比性，致使多種中藥在該測試中呈陽性。本研究用Ames測試檢測了7種中藥的致突變性，所有測試的中藥均呈陽性。 Ames測試菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，其生長量及瞬時生長速率不受培養(yǎng)基中組氨酸濃度的影響；處于衰亡期的Ames測試菌株TA100和TA98的相對回復(fù)突變頻率與測試體系中誘變劑的濃度間存在劑量效應(yīng)關(guān)系?；谏鲜龅慕Y(jié)果，建立一個根據(jù)試驗組與對照組中衰亡期的測試菌的相對回復(fù)突變頻率的差異性來評定物質(zhì)致突變性的方法。中藥所含

10、的組氨酸不會影響該測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，因而適于檢測中藥的致突變性，進(jìn)而推斷中藥的潛在致癌性。 通過測定中藥中組氨酸含量并結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析，證實這些中藥的“致突變性”源于中藥所含組氨酸導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。應(yīng)用新建方法測定了在Ames測試中呈“陽性”中藥的致突變性，在該測試中試驗組中測試菌的相對回復(fù)突變頻率與中藥濃度間不存在劑量效應(yīng)關(guān)系，并且試驗組與陰性對照組中測試菌的相對回復(fù)突變頻率無顯著性差異(t-test；p<0.05)，說明這些中

11、藥在該測試中呈陰性，即沒有致突變性，進(jìn)而推斷這些中藥沒有潛在致癌性。 三種中藥(銀杏葉、貓眼草、三棱)進(jìn)行了哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗，結(jié)果顯示所測試中藥均無致突變性，該測試結(jié)果進(jìn)一步佐證了新建方法檢測中藥致突變性的有效性，也說明該方法適于評價中藥的潛在致癌性。 三、改進(jìn)了應(yīng)用MutS蛋白檢測突變的方法 MutS蛋白在體外能識別并結(jié)合含有錯配堿基的DNA片段，多種基于此屬性的突變檢測方法應(yīng)運(yùn)而生。本文中實驗結(jié)

12、果證實，MutS蛋白在高劑量下亦能很好地結(jié)合純合雙鏈DNA，并且這種結(jié)合具有劑量依賴性；在低劑量下，MutS蛋白結(jié)合雜合雙鏈DNA的能力顯著強(qiáng)于其對純合雙鏈DNA的結(jié)合。 本研究中摒棄了測序法和代表性差異分析法，而采用能有效區(qū)別樣品間DNA量的微小差異的實時熒光定量PCR技術(shù)來檢測突變，直接比較實驗樣品與對照樣品的Ct值的差異來判斷、檢測突變。實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用大大簡化了檢測突變的過程。 另外，證實了用此種方法

13、能夠檢測在背景細(xì)胞中低至2％的突變體，是一種改進(jìn)的、簡便的、在DNA水平上檢測突變的方法。 四、極低比例的未知突變體檢測方法的探討及初步建立 多種檢測DNA片段多態(tài)性和突變的方法例如測序法及單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)只能檢測出群體中高比例的突變體(>9％)，對于更低比例的突變體則無法有效檢出。 用于檢測低比例的突變體的方法需要具有高分辨力和高靈敏度，目前滿足這兩個條件的檢測方法如芯片、生物電極等又因成本過高而難以

14、被普遍地應(yīng)用。本文設(shè)計了一個可提高群體中極低比例的突變體的相對及絕對含量的PCR程序，應(yīng)用此程序提高了突變體的相對及絕對含量后，用激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析了實驗樣品及對照樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物。實驗結(jié)果顯示，在毛細(xì)管電泳譜圖中，實驗樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物比對照樣品明顯地多出了一個峰，此峰是實驗樣品中極低比例的未知突變體(10-5)經(jīng)擴(kuò)增后被檢測到。此方法具有一定的可行性，但還需進(jìn)一步優(yōu)化條件以提高突變體的檢出效率，在此基礎(chǔ)上