石家莊灌溉用污水潛在致癌能力的研究.pdf

1、為緩解水資源短缺的狀況，世界上許多國家利用工業(yè)廢水和生活污水進行農(nóng)田灌溉。美國、德國和日本等發(fā)達國家，很早就意識到污水回用的重大意義，將城市污水再生處理后，用于農(nóng)業(yè)灌溉、地下水回灌、景觀生態(tài)用水、工業(yè)用水、綠化灌溉和其他用水。美國針對不同的回用對象，制定了嚴格的回用標(biāo)準。美國城市污水處理等級基本都在二級以上，處理率可以達到100％。目前，發(fā)達國家污水灌溉主要用于園林、牧草以及飼料作物，也用于某些經(jīng)濟作物，而很少應(yīng)用于糧食作物以及蔬菜。<

2、br>　　在我國一方面水資源緊缺，另一方面廢水的排放量逐年增加。為緩解水資源緊缺的現(xiàn)狀，我國大規(guī)模地利用污水進行農(nóng)田灌溉。城市污水集中處理后進行農(nóng)田灌溉，可以節(jié)約大量的水資源，提高水的再利用率，緩解供水壓力；可以充分利用其中的氮、磷資源，減少化肥的使用量。然而我國城鎮(zhèn)污水處理率不高，處理水平低。國內(nèi)外研究證實，污水中含有多種外來化學(xué)物，如鉛(Pb)、鉻(Cr)、鎘(Cd)等金屬以及多氯聯(lián)苯、鄰苯二甲酸酯類、多環(huán)芳烴類、雜環(huán)類化合物等有機

3、污染物。利用含有金屬和有機污染物的污水進行農(nóng)田灌溉，可能導(dǎo)致一些地區(qū)土壤中金屬和有機污染物蓄積，且有逐年加重的趨勢，致使土壤生產(chǎn)力下降，農(nóng)作物生長不良而造成減產(chǎn)，甚至顆粒無收。同時，由于這些化學(xué)污染物大多具有生物半減期長、脂溶性、難以降解、易于生物富集等特性，可以通過食物鏈逐級放大后進入到人體內(nèi)，從而對人體健康產(chǎn)生潛在的危害。人體攝入被金屬污染的飲用水或食物后，體內(nèi)必需微量元素就會被消耗，從而帶來一系列的健康問題，如免疫功能缺陷、宮內(nèi)發(fā)

4、育遲緩、營養(yǎng)缺乏相關(guān)的殘疾以及腫瘤的高發(fā)等。
　　河北省石家莊市是我國主要污灌區(qū)之一，主要為市區(qū)以南的幾個縣的部分地區(qū)，總面積約438.8km2。我教研室曾先后兩次對石家莊污灌區(qū)進行人口死因回顧性調(diào)查研究。20世紀80年代調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)全死因標(biāo)化死亡率污灌區(qū)為623.71/10萬，顯著高于凈灌區(qū)的557.22/10萬；惡性腫瘤標(biāo)化死亡率，污灌區(qū)為155.45/10萬，顯著高于凈灌區(qū)144.57/10萬，并且有逐年上升的趨勢，由197

5、7年的145.79/10萬上升到1982年的200.59/10萬。本教研室2008年再一次對污灌區(qū)進行了死因回顧性調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)污灌區(qū)的全死因標(biāo)化死亡率為525.78/10萬，顯著高于凈灌區(qū)的453.14/10萬；污灌區(qū)男性、女性惡性腫瘤標(biāo)化死亡率均顯著高于凈灌區(qū)。兩次調(diào)查結(jié)果表明污水灌溉可能是污灌區(qū)居民惡性腫瘤死亡率高于凈灌區(qū)和全國平均水平的一個重要影響因素，提示灌溉用污水可能有潛在致癌能力?；谌巳毫餍胁W(xué)調(diào)查結(jié)果，很有必要對灌溉用

6、污水的潛在致癌能力進行進一步研究，從而規(guī)范污水灌溉的管理，達到保護環(huán)境、預(yù)防疾病、促進健康的目的。
　　第一部分石家莊灌溉用污水中金屬和有機污染物的分析
　　目的：了解石家莊灌溉用污水中的主要成分。
　　方法：用電感耦合等離子體質(zhì)譜方法(ICP-MS)測定石家莊市灌溉用污水中金屬的含量；采用固相萃取的方法，提取水樣中的有機污染物，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)機(GC-MS)定性分析其中的有機污染物。
　　結(jié)果：ICP-MS測

7、定農(nóng)田灌溉用污水中金屬元素鉻(Cr)、錳(Mn)、鎳(Ni)、鈹(Be)、砷(As)、鎘(Cd)、鉛(Pb)的含量，應(yīng)用在線加入內(nèi)標(biāo)的方法來校正干擾效應(yīng)，加標(biāo)回收率為96％～102.3％，相對標(biāo)準偏差(RSD)小于3％，表明該方法的準確性和精密度良好。
　　所測水樣中各金屬Mn、Ni、Be、As、Cd含量均符合城市污水再生利用農(nóng)田灌溉用水水質(zhì)標(biāo)準(GB20922-2007)；上游和中游的樣本Cr濃度超過國家標(biāo)準，分別超過標(biāo)準2.3

8、和0.1倍；上游和下游的樣本Pb的濃度超過國家標(biāo)準，分別超過標(biāo)準的0.83和0.55倍。不同地點的混合樣本中Cr和Pb的濃度分別超過國家標(biāo)準0.78和0.43倍。GC-MS共檢出86個峰，選擇可信度大于70％的峰，共檢出30種有機化學(xué)物，主要有鄰苯二甲酸酯類、雜環(huán)類化合物、多環(huán)芳烴類化合物、苯胺類化合物等。
　　結(jié)論：石家莊灌溉用污水中Cr和Pb濃度超過國家標(biāo)準；GC-MS共檢出30種有機污染物，其中很多有機污染物是確認的人類致癌

9、物或可疑致癌物。
　　第二部分石家莊灌溉用污水短期致癌作用研究
　　目的：應(yīng)用配套短期致癌試驗對石家莊市灌溉用污水的短期致癌效應(yīng)進行評價。
　　方法：選擇反映不同遺傳學(xué)終點的短期致癌試驗。
　　鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(Ames)：選用平板摻入法。37℃預(yù)培養(yǎng)后，將含有0.5mM組氨酸-生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基分裝于試管中，然后每管依次加入增菌液0.1ml，不同濃度的受試物0.1ml(需代謝活化時，還需要另外加入

10、S9混合液0.5ml)，混合均勻，迅速鋪板。頂層瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h。受試物設(shè)四個劑量組，分別為25μl，50μl，75μl、100μl濃度的灌溉用污水樣品。同時設(shè)溶劑對照(蒸餾水)、陽性對照以及未處理對照。每個劑量設(shè)3個平行皿，重復(fù)2次。受試物平皿的實際回變菌落數(shù)是自發(fā)回變的菌落數(shù)2倍及以上，并且有劑量-反應(yīng)關(guān)系就可以認為該受試物誘變試驗陽性。
　　小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗：昆明小鼠按體重隨機分成5

11、組，每組10只，雌雄各半。三個不同濃度的劑量組分別含25％、50％、100％的灌溉用污水，自由飲用。蒸餾水為陰性對照，陽性對照組采用環(huán)磷酰胺(40mg/kg腹腔注射)。選擇兩個點進行取材，一個時間點是連續(xù)兩天暴露于受試物后取材；第二個時間點是亞急性連續(xù)15天暴露于受試物后取材。頸椎脫臼法處死小鼠后，取胸骨，涂片，自然干燥，甲醇固定后10％Giemsa染液染色10min，油鏡鏡檢。采用盲法進行計數(shù)分析。試驗組和陰性對照組相比，微核率差別有

12、統(tǒng)計學(xué)意義并有劑量反應(yīng)關(guān)系，即可判定為陽性結(jié)果。
　　單細胞凝膠電泳試驗：昆明小鼠按體重隨機分成5組，每組8只，雌雄各半。三個不同濃度的劑量組分別含25％、50％、100％灌溉用污水，自由飲用。蒸餾水為陰性對照，選用已知的能引起DNA損傷的苯巴比妥鈉為陽性對照(140mg/kg腹腔注射)。處死小鼠，制備肝細胞懸液，細胞密度為104～105個/ml。按常規(guī)彗星試驗三明治法制片。將載玻片置于新配置的預(yù)冷裂解液中，低溫避光裂解1h，于電

13、泳液避光解旋30min，室溫避光電泳30min(電壓25V，電流300mA)；電泳結(jié)束后取出載玻片用甲醇固定10min。用Milli-Q純水漂洗3次，每次3 min；3.2％的AgNO3染色30min，4℃預(yù)冷的顯色液顯色5min，甲醇脫色5min。每只動物計數(shù)100個細胞。普通光學(xué)顯微鏡下觀察，CASP彗星分析軟件分析Olive尾矩。
　　結(jié)果：
　　鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗：不加S9體外代謝活化系統(tǒng)，不同濃度的灌溉用污

14、水引起的TA98回變菌落數(shù)均大于未處理對照組的兩倍，并有劑量反應(yīng)(y=34.833+113.133x，rs=0.976，P=0.000)；加S9體外代謝活化系統(tǒng)，不同濃度的灌溉用污水引起的TA98回變菌落數(shù)均大于未處理對照組的兩倍，并有劑量反應(yīng)(y=42.833+124.133x，rs=0.954，P=0.000)。說明灌溉用污水具有致突變作用，內(nèi)含有直接和間接性移碼型的致突變物。
　　小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗：連續(xù)兩天暴露于

15、灌溉用污水，各組小鼠骨髓細胞微核率有顯著性差異(F=171.746，P=0.000)，陽性對照組小鼠骨髓細胞微核率與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；但不同劑量的污水處理組和陰性對照組相比，小鼠骨髓細胞微核率差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。連續(xù)15天染毒后，隨著染毒時間的延長，各組小鼠骨髓細胞微核率差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=71.706，P=0.000)；其中25％污水處理組小鼠骨髓細胞微核率和陰性對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義

16、(P>0.05)，50％和100％污水處理組小鼠骨髓細胞微核率和陰性對照組相比顯著增加(P<0.01)；隨著污水暴露濃度的增加，微核率顯著增加(y=0.003+0.007x，rs=0.814，P=0.000)。
　　單細胞凝膠電泳試驗：小鼠連續(xù)15天暴露于灌溉用污水，各組Olive尾矩數(shù)值顯著升高(x2=35.815，P=0.000)；25％污水處理組Olive尾矩和陰性對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，50％和100％

17、污水處理組Olive尾矩和陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；隨著污水暴露劑量的增加，Olive尾矩顯著增加(y=0.298+4.055x，rs=0.905，P=0.000)。
　　結(jié)論：
　　1 Ames試驗結(jié)果表明，石家莊灌溉用污水里面含有直接或間接地可以引起移碼型突變的污染物。
　　2小鼠骨髓細胞微核試驗的結(jié)果表明，石家莊灌溉用污水可能在小鼠體內(nèi)發(fā)生了物質(zhì)蓄積，并能引起染色體損傷。
　　3小鼠體

18、內(nèi)肝細胞彗星試驗的結(jié)果表明，石家莊灌溉用污水可以引起小鼠肝細胞DNA鏈斷裂，從而造成DNA損傷。
　　第三部分灌溉用污水對實驗性大鼠肝癌的促進作用
　　目的：在短期致癌試驗陽性結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用大鼠肝轉(zhuǎn)變灶誘發(fā)試驗對石家莊灌溉用污水的致癌作用進行進一步的研究。
　　方法：健康清潔級5周齡雄性SD大鼠，按體重隨機分為5組，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院實驗動物中心。大鼠適應(yīng)一周后，按Ito模式構(gòu)建大鼠兩階段肝癌促進模型，

19、A組用生理鹽水作為啟動劑，B、C、D、E組根據(jù)動物體重給大鼠一次性腹腔注射二乙基亞硝胺(DEN)200 mg/kg作為啟動劑。經(jīng)過為期兩周的恢復(fù)期飼養(yǎng)后，B、C、D、E組大鼠給予不同濃度的污水樣品(0％，25％，50％，100％)作為促進劑，暴露方式為自由飲用，A組大鼠自由飲用蒸餾水。第3周末按經(jīng)典方法進行2/3肝大部分切除術(shù)，恢復(fù)兩天后再暴露于不同濃度的污水，每周記錄一次動物體重、飲水及飼料消耗情況。第8周末實驗結(jié)束時，稱重后將其斷頭

20、處死，同時采集血樣進行生化分析。小心分離肝臟并稱重。一部分肝臟標(biāo)本直接用多聚甲醛固定，一部分用液氮冷凍后保存于-80℃冰箱中待用。根據(jù)南京建成試劑盒說明書測定大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)的濃度；HE染色病理切片觀察染毒大鼠肝組織病變；RT-PCR檢測大鼠肝組織GST-Pi mRNA的表達；免疫組化及Western blot檢測大鼠肝組織GST-Pi蛋白的表達。<

21、br>　　結(jié)果：
　　1大體觀察和臟器系數(shù)變化：在實驗結(jié)束的第8周，各組動物體重差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=27.925，P=0.000)，陰性對照組和25％污水處理組與DEN對照組相比動物體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，50％和100％污水處理組動物體重和DEN對照組相比顯著降低(P<0.01)；隨著污水暴露劑量的增加，大鼠體重顯著下降(y=414.146-53.136x，rs=-0.822，P=0.000)。不同濃度污水處理組大鼠肝

22、臟臟器系數(shù)有顯著性差異(F=6.961，P=0.000)，其中陰性對照組和25％污水處理組與DEN對照組相比大鼠肝臟臟器系數(shù)無顯著差異(P>0.05)，50％和100％污水暴露組大鼠肝臟臟器系數(shù)顯著高于DEN對照組(P<0.05)，隨著污水暴露劑量的增加，大鼠肝臟臟器系數(shù)顯著增加(y=2.935+0.359x，rs=0.459，P=0.004)，表明灌溉用污水具有促進大鼠肝細胞增殖的作用。各組大鼠攝食量和飲水量差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0

23、.05)。
　　2肝臟大體及病理形態(tài)學(xué)觀察：HE染色高倍鏡下25％灌溉用污水暴露組大鼠肝臟匯管區(qū)可見少量增生的卵圓細胞；50％劑量組的大鼠肝小葉組織結(jié)構(gòu)破壞，可見肝細胞再生性結(jié)節(jié)和小細胞增生灶；在100％劑量組，大鼠肝小葉組織結(jié)構(gòu)破壞更為嚴重，有纖維組織增生和假小葉形成，匯管區(qū)可見大量卵圓細胞增生。
　　3灌溉用污水對肝功能的影響：各組大鼠的血清中AST濃度有顯著性差異(x2=35.735，P=0.000)；陰性對照組和25

24、％污水處理組的大鼠血清AST濃度與DEN對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；50％和100％污水處理組大鼠血清中AST濃度也顯著高于DEN對照組(P<0.01)；隨著污水暴露劑量的增加，AST濃度也顯著增加(y=57.620+248.277x，rs=0.928，P=0.000)。各組大鼠血清ALT濃度差別有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=38.684，P=0.000)，陰性對照組與DEN對照組相比大鼠血清ALT濃度無顯著性差異(P>0.05)

25、，而各污水處理組的大鼠血清ALT濃度顯著高于DEN對照組(P<0.01)；隨著染毒劑量的增加，ALT濃度也顯著增加(y=14.540+246.921x，rs=0.960，P=0.000)。各組大鼠血清γ-GT濃度差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.987，P=0.000)，其中陰性對照組、25％和50％污水處理組的大鼠血清γ-GT濃度與DEN對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，100％污水處理組的大鼠血清中γ-GT濃度與DEN對照組比

26、較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各劑量組的大鼠血清AKP濃度未觀察到顯著差異(F=1.824，P=0.144)。
　　4肝組織中GST-Pi mRNA的表達：在DEN啟動作用下，給予大鼠暴露不同濃度的污水后，各組大鼠肝臟GST-Pi mRNA表達量差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=37.904，P=0.000)。陰性對照組和25％污水處理組，大鼠肝臟GST-Pi mRNA表達量與DEN對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；大鼠暴露

27、50％和100％的灌溉用污水后，誘導(dǎo)大鼠肝臟GST-PimRNA表達量與DEN對照組相比均顯著增加(P<0.01)；隨著污水暴露劑量的升高，誘導(dǎo)GST-Pi mRNA表達量顯著增加，在100％污水處理組表達量最高(y=1.029+1.060x，rs=0.950，P=0.000)。
　　5肝組織中GST-Pi蛋白的表達：GST-Pi蛋白在陰性對照組和DEN對照組的大鼠肝組織中僅有少量表達。在DEN啟動作用下，給予大鼠暴露不同濃度的污

28、水后，誘導(dǎo)GST-Pi蛋白表達量各組之間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=268.176，P=0.000)，其中陰性對照組和DEN對照組相比大鼠肝臟GST-Pi蛋白表達量無顯著性差異(P>0.05)，而不同濃度的污水處理組與DEN對照組相比大鼠肝臟GST-Pi蛋白表達量顯著增加(P<0.01)，隨著污水暴露濃度的增加，GST-Pi蛋白表達量顯著增加(y=0.470+0.823x，rs=0.972，P=0.000)。
　　免疫組織化學(xué)的方法在陰

29、性對照組未觀察到GST-Pi蛋白的表達。在DEN啟動作用下，DEN對照組的大鼠肝組織中僅有少量表達。在DEN啟動作用下，給予大鼠暴露不同濃度的污水后，誘導(dǎo)GST-Pi蛋白表達量與DEN對照組相比均明顯增加，在100％污水處理組表達量最高，污水暴露濃度與GST-Pi蛋白表達量之間呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論：石家莊灌溉用污水有促癌作用，能引起Ito模型大鼠體重顯著下降，肝臟臟器系數(shù)顯著升高，并能引起肝功能異常，誘導(dǎo)肝組織中GST

30、-Pi在mRNA水平和蛋白表達升高。
　　第四部分 CYP1A1和CYP1B1在灌溉用污水促癌實驗中的作用
　　目的：研究細胞色素CYP1A1和CYP1B1在灌溉用污水促癌試驗中的作用
　　方法：動物模型同第三部分。用RT-PCR和Western blot方法觀察CYP1A1和CYP1B1在mRNA及蛋白水平的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1灌溉用污水對大鼠肝臟CYP1A1 mRNA及蛋白表達的影響：各組大鼠

31、肝臟CYP1A1 mRNA表達有顯著性差異(F=73.054，P=0.000)；陰性對照組的大鼠肝臟CYP1A1 mRNA表達和DEN對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但不同濃度的污水暴露組的大鼠肝臟CYP1A1mRNA表達和DEN對照組相比顯著增加(P<0.01)；隨著污水暴露劑量的增加，其表達量顯著增加(y=0.346+0.621x，rs=0.941，P=0.000)。各組CYP1A1蛋白的表達量差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.

32、788，P=0.007)；陰性對照組和25％污水暴露組的大鼠肝臟CYP1A1蛋白表達量和DEN對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，50％和100％污水暴露組的大鼠肝臟CYP1A1蛋白表達量和DEN對照組相比顯著增高(P<0.05)，隨著污水暴露劑量的增加，其表達量顯著增加(y=0.557+0.316x，rs=0.799，P=0.001)。
　　2灌溉用污水對大鼠CYP1B1 mRNA及蛋白表達的影響：各組大鼠肝臟CYP1B

33、1 mRNA表達差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.539，P=0.001)；其中陰性對照組的大鼠肝臟CYP1B1 mRNA表達和DEN對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但不同濃度的污水暴露組大鼠肝臟CYP1B1mRNA表達量和DEN對照組相比顯著增加(P<0.05)；隨著污水暴露劑量的增加，CYP1B1 mRNA表達量顯著增加(y=0.527+0.313x，rs=0.907，P=0.000)。各組大鼠CYP1B1蛋白表達有顯著性差異

34、(F=8.247，P=0.003)；其中陰性對照組的大鼠肝臟CYP1B1蛋白表達水平和DEN對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但不同濃度的污水暴露組大鼠肝臟CYP1B1蛋白表達水平和DEN對照組相比顯著增加(P<0.05)；隨著污水暴露劑量的增加，CYP1B1蛋白表達量顯著增加(y=0.530+0.528x，rs=0.789，P=0.002)。
　　結(jié)論：石家莊市灌溉用污水可以誘導(dǎo)細胞色素P4501A1和P4501B1的