玉米微管結合蛋白ZmMAP65-1a和轉錄因子ZmNAC在非生物脅迫中的功能研究.pdf

1、干旱、高鹽和低溫是影響植物生長、發(fā)育和限制作物產(chǎn)量提高的主要非生物脅迫因素。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物應答非生物脅迫與微管的動態(tài)變化有著密切的聯(lián)系。微管的這種動態(tài)變化需要微管結合蛋白(microtubule-associated proteins，MAPs)的精確調(diào)控，MAP65就是其中一種非常重要的微管結合蛋白。
　　運用RT-PCR技術在玉米幼苗葉片中克隆出1個玉米微管結合蛋白ZmMAP65-1a。進化樹分析表明，ZmMAP65-1

2、a與水稻MAP65-1高度同源，編碼產(chǎn)物為584個氨基酸，分子量為65.18kD，等電點為4.845。結構分析表明ZmMAP65-1a微管結合區(qū)MTB2存在著磷酸化位點，亞細胞定位實驗表明ZmMAP65-1a可能定位在微管上。
　　首先利用玉米原生質(zhì)體瞬時表達和瞬時沉默體系研究表明ZmMAP65-1a參與了BR誘導的抗氧化防護。瞬時表達mMAP65-1a能顯著提高抗氧化防護酶SOD和APX的基因表達和酶活性，而瞬時沉默mMAP65

3、-1a則出現(xiàn)相反的結果。進一步利用原生質(zhì)體瞬時沉默體系研究表明，ZmMAP65-1a通過調(diào)節(jié)NADPH氧化酶基因ZmrbohA-D的表達參與了BR誘導的玉米原生質(zhì)體中H2O2的產(chǎn)生。其次利用雙分子熒光互補實驗(BiFC)體內(nèi)證明了ZmMAP65-1a與ZmMPK5互作，體外磷酸化實驗表明ZmMPK5直接磷酸化ZmMAP65-1a。并且進一步證明了ZmMAP65-1a與ZmMPK5在BR誘導的抗氧化防護中存在相關性，這些結果表明ZmMPK

4、5參與BR誘導的抗氧化防護的一條途徑是通過磷酸化ZmMAP65-1a完成的。
　　已有證據(jù)顯示，BR處理可以誘導玉米葉片ABA的積累。利用原生質(zhì)體瞬時表達和瞬時沉默體系研究表明ZmMAP65-1a參與了ABA誘導的抗氧化防護。ABA合成抑制劑實驗表明ABA參與了BR對ZmMAP65-1a、ZmrbohA-D基因表達和ZmMPK5激酶活性的上調(diào)作用。這些結果表明ZmMAP65-1a與ZmMPK5參與BR誘導的抗氧化防護是通過BR誘導

5、ABA產(chǎn)生進而將信號傳遞下去。
　　NAC轉錄因子是一類植物特有的轉錄因子，它的命名來源于牽?；∟AM、擬南芥ATAF1/2和CUC2基因的首個字母。作為一類龐大的基因家族，NAC轉錄因子參與了植物的很多生理進程包括發(fā)育、衰老、次生壁建成、應答生物和非生物脅迫。本實驗利用玉米原生質(zhì)體瞬時表達、瞬時沉默和顯性嵌合抑制沉默體系分析ZmNAC在ABA依賴的脅迫信號途徑中的作用，并進一步研究其與ZmCCaMK互作在抗氧化防護中的作用，同時

6、構建了過表達ZmNAC的轉基因煙草初步探索了其在逆境脅迫中的初步功能。
　　運用生物信息學詳細分析ZmNAC的結構特性，Zm NAC編碼431個氨基酸，分子量為47.94kD，等電點為7.74，具有一個保守的N端NAM結構域，位于43aa-204aa。亞細胞定位顯示其位于細胞核，酵母轉錄激活實驗表明其具有轉錄激活活性，且C端為其轉錄激活區(qū)。凝膠遷移實驗(EMSA)表明ZmNAC可以與玉米ZmERD1基因啟動子的順式作用元件CATG

7、TG結合。熒光定量PCR實驗結果顯示ZmNAC在玉米各種組織中組成型表達，與其他組織相比在雌花中表達量最高，并且響應各種非生物脅迫和外源激素處理。
　　首先利用玉米原生質(zhì)體瞬時表達、瞬時沉默和顯性嵌合抑制沉默體系研究表明ZmNAC參與ABA誘導的抗氧化防護。進一步研究發(fā)現(xiàn)ZmNAC通過調(diào)節(jié)玉米NADPH氧化酶基因ZmrbohA-D的基因表達參與調(diào)節(jié)ABA誘導的H2O2的產(chǎn)生。ABA合成抑制劑實驗表明ZmNAC響應NaCl、PEG的

8、脅迫信號依賴于或部分依賴于ABA。利用雙分子熒光互補實驗(BiFC)體內(nèi)證明了ZmCCaMK與ZmNAC互作，并且證明了ZmCCaMK與ZmNAC在ABA誘導的抗氧化防護中存在相關性，進一步研究發(fā)現(xiàn)ZmCCaMK與ZmNAC的相互作用同樣影響玉米原生質(zhì)體H2O2的產(chǎn)生。體外磷酸化實驗表明ZmCCaMK可以直接磷酸化ZmNAC，并利用點突變實驗找到了影響ABA誘導的SOD和APX酶活性ZmNAC可能的磷酸化位點。另外本實驗構建了ZmNAC