擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫響應(yīng)中的功能研究.pdf

1、干旱、鹽脅迫和酸性土壤中的鋁毒害是造成作物減產(chǎn)的主要非生物逆境，而植物響應(yīng)這些脅迫的信號轉(zhuǎn)導以及分子調(diào)控機制仍有待進一步的研究和拓展。轉(zhuǎn)錄因子在植物信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了極其重要的作用，它們一方面接受被感知的信號進而調(diào)控下游基因的表達，另一方面又能成為一個節(jié)點，協(xié)調(diào)不同信號途徑之間的相互作用。因此，對轉(zhuǎn)錄因子逆境響應(yīng)的功能研究是我們從分子水平上認識植物如何適應(yīng)惡劣環(huán)境的重要基礎(chǔ)。WRKY家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其調(diào)控范圍涵蓋植物

2、生長發(fā)育和逆境響應(yīng)等多種生理活動。盡管WRKY蛋白在生物脅迫反應(yīng)中已得到了廣泛的研究，但其在非生物脅迫應(yīng)答中的研究還處于起步階段。本文對擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的33個WRKY基因進行表達分析，最終篩選到了2個WRKY（WRKY46和WRKY41）參與快速響應(yīng)過氧化氫和鎘的處理，隨后對這2個基因的功能進行了系統(tǒng)的研究。主要結(jié)果分為以下四個方面:
　　1、WRKY46調(diào)控滲透脅迫響應(yīng)以及光依賴的氣孔運動<

3、br>　　在多種非生物脅迫的處理中，WRKY46對水分脅迫（干旱、滲透和鹽脅迫）的響應(yīng)尤為明顯。干旱和鹽脅迫在短時間內(nèi)便可顯著提高WRKY46的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平。WRKY46 T-DNA插入突變體對干旱和鹽脅迫十分敏感，表現(xiàn)為突變體地上部生長差于野生型。然而，WRKY46過表達株系在平板處理條件下（封閉的環(huán)境）對鹽和滲透脅迫有較高的耐性，但在土培條件下（開闊的環(huán)境）卻對干旱和鹽脅迫非常敏感。原因是WRKY46過表達植株的葉片具有較高的

4、失水率。進一步研究發(fā)現(xiàn)，WRKY46的過表達可以抑制保衛(wèi)細胞中ROS(reactive oxygenspecies)的產(chǎn)生，從而破壞ABA(abscisic acid)誘導的氣孔關(guān)閉過程。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)WRKY46受光的誘導表達，并且其在保衛(wèi)細胞中的表達不受干旱等處理的影響。WRKY46在保衛(wèi)細胞中的主要作用可能是參與光依賴的氣孔打開過程?；蛐酒治霭l(fā)現(xiàn)，WRKY46調(diào)控了一系列參與細胞滲透保護和氧化還原平衡的基因的表達。此外，W

5、RKY46也通過調(diào)控QQS(QUA-QUINESTARCH)基因的表達來調(diào)控保衛(wèi)細胞中的淀粉代謝，從而調(diào)節(jié)氣孔的打開過程。
　　因此，WRKY46在脅迫應(yīng)答和氣孔調(diào)控中發(fā)揮了兩種獨立的作用:一是調(diào)控干旱和鹽脅迫下植物細胞的滲透保護和降低氧化脅迫;二是通過調(diào)控保衛(wèi)細胞中淀粉的代謝來調(diào)節(jié)氣孔的打開。
　　2、WRKY46調(diào)控鹽和滲透脅迫下的側(cè)根發(fā)育
　　組織定位分析表明，WRKY46在側(cè)根發(fā)育初期的根原基以及成熟側(cè)根的中柱

6、中表達。WRKY46的功能缺失導致植株在鹽和滲透脅迫下的側(cè)根發(fā)育受到明顯的抑制（相對于野生型）。相反，WRKY46的過表達能夠增強植株在脅迫下的側(cè)根發(fā)育。外源添加生長素可以極大地回復wrky46突變體在脅迫下的側(cè)根表型，而生長素極性運輸抑制劑(TIBA)同時抑制野生型和WRKY46過表達植株在脅迫下的側(cè)根發(fā)育，說明WRKY46對側(cè)根的調(diào)控依賴生長素。對WRKY46的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，WRKY46在根中的表達受到ABA的顯著抑制，但同時在

7、鹽或滲透脅迫下，WRKY46也受到ABA以外的信號調(diào)控。DR5(∶)GUS在wrky46突變體中的表達明顯低于在野生型中的表達。與此吻合的是，突變體根中游離IAA的含量出現(xiàn)降低，而橋連IAA的含量有所提高（相對于野生型）;而WRKY46過表達株系的IAA含量變化與突變體正好相反?；虮磉_分析發(fā)現(xiàn)，WRKY46在鹽或滲透脅迫下調(diào)控ABI4(ABAINSENSITIVE4)和參與生長素橋連的相關(guān)基因的表達。染色質(zhì)免疫共沉淀進一步證實WRKY

8、46可以直接結(jié)合到這些基因的啟動子上。以上結(jié)果證明，WRKY46通過調(diào)控ABA信號途徑和生長素內(nèi)穩(wěn)態(tài)進而參與前饋抑制鹽或滲透脅迫對植物側(cè)根的抑制。
　　3、WRKY46調(diào)控鋁誘導的蘋果酸分泌
　　ALMT1編碼蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白，是擬南芥一關(guān)鍵耐鋁基因。我們發(fā)現(xiàn)在基因芯片中，ALMT1的表達明顯受到WRKY46的抑制。在鋁處理條件下，WRKY46的表達在處理3小時后出現(xiàn)顯著的下調(diào)，而ALMT1的表達受鋁處理的誘導。而且在組織表達

9、上，WRKY46和ALMT1在擬南芥根中存在共同的表達區(qū)域，即兩者均在根的中柱表達，說明兩者可能存在調(diào)控關(guān)系。表型分析發(fā)現(xiàn)，wrky46突變體在鋁處理下表現(xiàn)出較高的鋁耐性（相對于野生型），并且突變體含有較低的根系鋁含量。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ALMT1在wrky46突變體中的表達明顯提高，從而增強突變體根系蘋果酸的分泌，緩解鋁毒。煙草中的瞬時表達實驗表明，WRKY46可以抑制ALMT1的表達。利用酵母單雜和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進一步證實，WR

10、KY46可以直接結(jié)合到ALMT1啟動子中的W-box上。以上結(jié)果證明，WRKY46是關(guān)鍵耐鋁基因ALMT1的負調(diào)控因子，WRKY46的功能缺失提高根系蘋果的分泌，從而降低根系的鋁含量，提高植株對鋁的耐性。
　　4、WRKY41調(diào)控種子休眠
　　盡管WRKY41也能快速響應(yīng)過氧化氫和鹽脅迫的誘導，但WRKY41的功能缺失突變體wrky41對這些處理的響應(yīng)與野生型無明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)，WRKY41主要在種子中表達。WRKY41的

11、功能缺失導致種子的初生休眠和熱脅迫下產(chǎn)生的次生休眠都顯著降低，并且wrky41的種子萌發(fā)和幼苗生長對ABA不敏感。而這種表型與ABI3(ABA INSENSITIVE3)的功能缺失十分相似。基因表達分析發(fā)現(xiàn)，WRKY41的缺失明顯降低ABI3在種子發(fā)育以及萌發(fā)過程中的表達，而過表達WRKY41可以提高ABI3的表達。而且，在wrky41中過表達ABI3可以完全回復突變體種子休眠相關(guān)的表型。凝膠阻滯和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗證明，WRKY41