玉屏風(fēng)多糖提取和成分分析及對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化預(yù)防作用及機(jī)制研究.pdf

1、玉屏風(fēng)散由黃芪[Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.Var.Mongholicus (Bge.) Hsiao]、白術(shù)(炒)[Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (baked)]、防風(fēng)[Saposhnikovia divaricata (Turez.) Schischk.]三味組成，為治療表虛自汗的經(jīng)典名方?，F(xiàn)代中藥研究認(rèn)為，由于中藥獨(dú)特用藥體系和多以復(fù)方形式用藥的特

2、點(diǎn)，中藥復(fù)方真正發(fā)揮藥理作用的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，是指復(fù)方中產(chǎn)生某種藥效活性物質(zhì)的總和，因此研究中我們從玉屏風(fēng)散整體出發(fā)追蹤其多糖類活性成分，而非分別研究三味組成單藥的活性多糖再加以配伍組合。在我們的前期研究中，對玉屏散總多糖進(jìn)行了分級分離，通過活性篩選證實(shí)了玉屏風(fēng)多糖（YPF-P）為玉屏風(fēng)散中最具藥理活性的多糖類成分，且發(fā)現(xiàn)YPF-P對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫力低下小鼠具有免疫調(diào)節(jié)活性，對于急性化學(xué)性及急性免疫性肝損傷均具有一定的肝臟保護(hù)作用。在

3、此基礎(chǔ)上，本課題組秉持藥物化學(xué)研究與藥理研究密切結(jié)合的研究思路，一方面從玉屏風(fēng)散復(fù)方整體中優(yōu)化提取YPF-P，并通過多種化學(xué)及儀器檢測深入研究YPF-P的組成及結(jié)構(gòu)，為闡明玉屏風(fēng)散活性多糖的構(gòu)效關(guān)系提供化學(xué)基礎(chǔ)；另一方面，通過CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，從血清學(xué)、組織學(xué)、分子生物學(xué)等水平系統(tǒng)觀察YPF-P對大鼠肝纖維化的防治作用及其可能的發(fā)生機(jī)制，并考察YPF-P及其主成分多糖YPF-P1對體外培養(yǎng)的HSC-T6生長及對TGF-β1

4、刺激后HSC-T6增殖的影響，為抗肝纖維化治療研究和臨床慢性肝病的防治提供新的藥物選擇。研究主要內(nèi)容如下：
　　 1.玉屏風(fēng)多糖（YPF-P）的制備及多糖組成結(jié)構(gòu)研究
　　 YPF-P制備實(shí)驗(yàn)旨在通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選YPF-P的提取工藝條件，并建立YPF-P的含量測定方法。實(shí)驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法制備玉屏風(fēng)散活性多糖，通過分光光度計(jì)以苯酚硫酸法測定多糖含量，以多糖提取量為指標(biāo)優(yōu)選YPF-P最佳提取工藝。結(jié)果提

5、示，YPF-P提取的最佳條件為料液比1:15，于90°С提取3次，每次2h。實(shí)驗(yàn)中成功建立了YPF-P的含量測定方法，驗(yàn)證試驗(yàn)表明優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定、合理、可行。
　　 YPF-P組成結(jié)構(gòu)研究旨在考察YPF-P的組成及其主成分多糖（YFP-P1）的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，以期闡明復(fù)方玉屏風(fēng)散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)從復(fù)方玉屏風(fēng)散中經(jīng)水提醇沉、脫蛋白后得到Y(jié)PF-P，先后經(jīng)DEAE sephadex A-25柱分離和Sephadex G-20

6、0柱進(jìn)一步純化，得到3個重均分子量均一的多糖YPF-P1、YPF-P2、YPF-P3，通過高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測定多糖分子量；通過多糖完全酸水解，通過薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）兩種方法進(jìn)行YPF-P1單糖組成研究，并進(jìn)行高碘酸氧化、紅外光譜（IR）、1H-NMR 及13C-NMR譜檢測以掌握YFP-P1的基本結(jié)構(gòu)特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YPF-P的組成多糖分子量分別為YPF-P1（488,500Da）、YP

7、F-P2（232,500Da）、YPF-P3（1,863,000Da）；YPF-P1為一高度分支化的雜多糖，由葡萄糖（Glc）,半乳糖（Gal），果糖（Fru）及阿拉伯糖（Ara）以摩爾比3: 2.5: 1.75: 1 組成，此外還含有微量的鼠李糖（Rha），半量的Gal以半乳糖醛酸（GalA）形式存在，主鏈部分由1，6-α-D-吡喃葡萄糖苷、1，6-β-D-吡喃半乳糖以6: 5構(gòu)成，側(cè)鏈部分由1，3-β-D-呋喃果糖苷，甲基-β-呋喃

8、阿拉伯糖苷和/或甲基-α-鼠李糖苷構(gòu)成，與葡萄糖殘基O-6相連。
　　 2.玉屏風(fēng)多糖（YPF-P）對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的預(yù)防作用及機(jī)制研究
　　 實(shí)驗(yàn)旨在考察YPF-P對大鼠肝纖維化的藥效作用及部分機(jī)制，并研究對HSC-T6細(xì)胞株增殖的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過給予SD大鼠皮下注射CCl4花生油溶液 12周，每周2次，成功建立肝纖維化模型；大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，YPF-P (30，60，120 mg·kg-1)三劑量組，

9、黃芪多糖（AP）60 mg·kg-1組，秋水仙堿陽性藥對照組；采用Masson染色觀察肝臟病理組織學(xué)改變，電鏡觀察肝細(xì)胞、HSC形態(tài)，放免法測定血清HA、LN、CIV、PCIII水平，血清TGF-β1水平及肝組織TGF-β1蛋白含量分別由ELISA和免疫組化法測定，肝組織α-SMA蛋白與Mrna水平經(jīng)免疫組化法和RT-PCR法測定，TIMP-1、MMP-13、Procollagen、Collagen Ш Mrna均經(jīng)RT-PCR法測定。

10、結(jié)果顯示，YPF-P能夠顯著減輕肝纖維化病變程度，抑制HSC向MFb的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，顯著降低肝纖維化時(shí)升高的血清HA、LN、CIV、PCIII、TGF-β1水平，減少肝組織TGF-β1蛋白及α-SMA蛋白、基因的表達(dá)，顯著抑制TIMP-1、Procollagen、Collagen III Mrna表達(dá)，促進(jìn)TIMP-1/MMP-13 比例恢復(fù)，除YPF-P 120 mg·kg-1組增加MMP-13 Mrna表達(dá)(p<0.05)外，其它YPF

11、-P組對其表達(dá)無顯著性差異；與AP相比，YPF-P在HA、TGF-β1、TIMP-1 Mrna、TIMP-1/MMP-13 ratio、procollagen Mrna (p<0.05)，PCШ和collagen Ⅲ Mrna表達(dá) (p<0.01)上都具有更佳的療效，但在血清LN，CIV和MMP-13 Mrna表達(dá)上無顯著性差異。結(jié)果提示YPF-P能夠有效預(yù)防CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的形成，延緩纖維化進(jìn)程，作用呈劑量依賴趨勢，YPF-

12、P比AP更具有藥效優(yōu)勢，其機(jī)制與抑制TGF-β1表達(dá)、恢復(fù)TIMP-1/MMP-13酶系的平衡，抑制基質(zhì)膠原的生成促進(jìn)降解有關(guān)。
　　 體外實(shí)驗(yàn)中，通過繪制細(xì)胞生長曲線觀察YPF-P、YPF-P1對HSC-T6生長的影響，采用MTT法考察YPF-P、YPF-P1對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖的影響。結(jié)果表明，YPF-P（50、100、200mg/L）、YPF-P1（100、200mg/L）給藥均可抑制正常HSC-T6的增殖

13、；YPF-P 50-200mg/L（p<0.01），YPF-P1 12.5-25mg/L（p<0.05）、50-200 mg/L（p<0.01）均可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖；YPF-P1增殖抑制率多高于同等劑量的YPF-P（100 mg/L除外），24h內(nèi)YPF-P增殖抑制率高于YPF-P1。結(jié)果提示，YPF-P、YPF-P1均具有對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖抑制作用，YPF-P發(fā)揮作用較快，YPF-P1在抑制強(qiáng)度