基于金納米粒的生物分子化學(xué)發(fā)光分析新技術(shù).pdf

1、金納米(AuNPs)粒具有優(yōu)良的電學(xué)、光學(xué)、熱力學(xué)與催化性能，已廣泛地應(yīng)用于物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)及其交叉學(xué)科。AuNPs毒性小、粒徑小，易于被細(xì)胞攝取，經(jīng)功能化修飾后，可以用于生物成像、藥物與基因傳遞等治療與診斷領(lǐng)域。另外，AuNPs具有卓越的電傳導(dǎo)性、等離子體共振特性和高催化性，且其表面易于修飾，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于構(gòu)建光學(xué)、電化學(xué)等生物傳感器。
　　 化學(xué)發(fā)光(CL)分析法是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光的強(qiáng)度來確定物質(zhì)

2、含量的分析方法。CL分析技術(shù)具有分析速度快、靈敏度高、儀器設(shè)備簡單、線性范圍廣且適用于微量分析等特性，己廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。功能化AuNPs既可用作CL底物的載體；另一方面，由于AuNPs尺寸小、表面效應(yīng)明顯，因此也具有CL催化劑的作用，如AuNPs可以催化銀離子形成銀原子沉積在AuNPs的表面，同時(shí)促進(jìn)魯米諾自由基的形成，后者可與溶液中溶解的氧反應(yīng)產(chǎn)生CL信號(hào)。因而，AuNPs可以顯著增大CL強(qiáng)度。Luminol-AgNO3

3、-AuNPsCL體系已經(jīng)用于CL免疫分析、DNA以及有機(jī)小分子的含量測定。本論文將AuNPs催化的CL技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了一系列具有創(chuàng)新意義的基于金納米粒的人血漿蛋白、腺苷及端粒酶活性CL分析法。整個(gè)論文由以下五個(gè)部分組成：
　　 第一章緒論
　　 金納米粒作為一種具有獨(dú)特理化性質(zhì)的貴金屬納米粒子，一直是科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。本章簡單介紹了金納米粒的合成方法、優(yōu)良性能，并且詳細(xì)綜述了金納米粒在藥物與基因傳遞、診斷與成

4、像、生物傳感器以及CL催化等領(lǐng)域中的應(yīng)用，著重介紹了金納米粒作為一種高效的催化劑在魯米諾CL體系中的重要意義。
　　 第二章基于金納米粒的適配體體系用于IgE的分析
　　 核酸適配體(Aptamers，適配體)是指利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)，從隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸庫中篩選得到的能夠與靶分子特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療、診斷與生物技術(shù)研究。人免疫球蛋白E(IgE)是五種免疫球蛋白的一

5、種，對過敏反應(yīng)有著重要的作用。與其他免疫球蛋白不同的是人血漿中IgE的含量極低，但是過敏性哮喘病人體內(nèi)的IgE含量會(huì)升高。本章發(fā)展了基于適配體識(shí)別，AuNPs放大體系用于IgE的高選擇性、高靈敏CL分析。本策略主要依賴于固定至聚苯乙烯微孔板上的捕獲抗體、目標(biāo)蛋白和適配體功能化金納米粒(Apt-AuNPs)三者之間形成“三明治”結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物。只有在加入目標(biāo)蛋白的情況下，金納米粒才能組裝于微孔板上，組裝成功的AuNPs進(jìn)而催化魯米諾.硝

6、酸銀CL體系產(chǎn)生CL信號(hào)。為了使CL信號(hào)進(jìn)一步放大，隨后在金納米粒表面進(jìn)行了簡單的氯金酸催化的沉積反應(yīng)。該CL信號(hào)放大技術(shù)可使模型蛋白IgE的最低檢測限達(dá)到50fM，優(yōu)越于已報(bào)道的其他基于適配體的IgE檢測技術(shù)。該檢測方法專屬性強(qiáng)，能夠較為理想地分辨出IgE，而不受其它血漿蛋白的干擾，如IgG、IgA和IgM等，已成功應(yīng)用于35個(gè)人血樣中IgE含量的檢測，與對照值相關(guān)性良好。綜合而言，該檢測方法具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，如最低檢測限能夠達(dá)到fM級(jí)

7、別、線性范圍廣(跨度達(dá)4個(gè)數(shù)量級(jí))，可以拓寬至基于適配體的其它蛋白的含量測定，有望在臨床、環(huán)境以及生物防御等領(lǐng)域的目標(biāo)蛋白高靈敏、高選擇性檢測中獲得應(yīng)用。
　　 第三章基于適配體-金納米粒識(shí)別檢測的血小板衍生化生長因子化學(xué)發(fā)光分析新技術(shù)
　　 血小板衍生化生長因子(PDGF)可通過與特異的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞分裂繁殖。因此，PDGF在血管增生中起著重要的作用，并且與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤生長及進(jìn)展存在著密切聯(lián)系。作為

8、PDGF的重要亞型，PDGF-BB在正常細(xì)胞中的含量極低，甚至檢測不到。但是在膠質(zhì)瘤和肉瘤等腫瘤中，PDGF-BB水平會(huì)急劇升高。因此，作為一種腫瘤標(biāo)志物，PDGF-BB的含量測定在癌癥診斷與治療中有著重要的意義。本章發(fā)展了一種新型的、基于適配體識(shí)別-金納米標(biāo)記的CL分析技術(shù)，用于。PDGF-BB的高靈敏度檢測。該技術(shù)首先將PDGF-BB抗體通過氨基.羧基反應(yīng)結(jié)合至表面具有活性羧基的96孔板上；而生物素標(biāo)記的PDGF-BB適配體序列，預(yù)

9、先組裝于鏈霉親和素金納米粒上形成Apt-AuNPs復(fù)合物；在PDGF-BB作用下發(fā)生夾心反應(yīng)，Apt-AuNPs復(fù)合物結(jié)合于96孔板上；通過羥胺(NH2OH)與氯金酸(HAuCl4)的氧化還原反應(yīng)，將96孔板上結(jié)合的AuNPs進(jìn)一步催化放大形成具有更大表面積的粒子，最后采用luminol-AgNO3體系測定其CL信號(hào)強(qiáng)度。最優(yōu)條件下，PDGF-BB的線性范圍為0.1～1000 pM(LgI=0.9524LgC+1.4995，R2=0.9

10、883)，檢測限為10fM。此外，專屬性實(shí)驗(yàn)表明：相同濃度的PDGF-AA、PDGF-AB、干擾素a2b及免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)對PDGF-BB的測定無明顯干擾。綜合而言，本章建立的CL方法能夠簡單、靈敏、高效地檢測PDGF-BB，并有望擴(kuò)展到其他蛋白的分析。
　　 第四章基于核酸外切酶輔助循環(huán)放大的高靈敏化學(xué)發(fā)光傳感器
　　 腺苷作為一種嘌呤核苷，在生物化學(xué)上扮演重要角色，包括以腺苷三磷酸或腺苷雙磷酸形式

11、轉(zhuǎn)移能量，或是以環(huán)狀腺苷單磷酸進(jìn)行信號(hào)傳遞等，此外腺苷也是一種抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)物，可能會(huì)促進(jìn)睡眠。因此，監(jiān)測生理?xiàng)l件下的腺苷水平有著重大的意義。核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)對雙鏈DNA具有高度特異性，能降解平滑末端、3’凹陷末端及有切口的雙鏈DNA，但是不能降解單鏈DNA與3’-突出末端雙鏈DNA。本章我們利用ExoⅢ輔助循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)，構(gòu)建了新型的AuNPs催化CL適配體傳感器用于腺苷的高靈敏檢測分析。腺苷適配體通過與96孔板上的捕獲探針

12、雜交固定于96孔板上；同時(shí)合成報(bào)告探針功能化的金納米粒，此AuNPs表面的報(bào)告探針與上述腺苷適配體末端部分堿基互補(bǔ)。在腺苷存在的情況下，腺苷適配體會(huì)折疊形成雙鏈DNA將腺苷包裹起來，加入ExoⅢ，雙鏈DNA從3’-OH端開始逐漸降解直到腺苷釋放出來，釋放出來的腺苷再次與96孔板上的腺苷適配體結(jié)合，降解得到的單鏈DNA由于3’-端降解失去四個(gè)堿基，不能夠再與AuNPs表面的DNA堿基形成穩(wěn)定配對，從而影響AuNPs在96孔板上的結(jié)合，進(jìn)而

13、降低所測得的CL信號(hào)強(qiáng)度。CL信號(hào)減弱強(qiáng)度與腺苷濃度線性相關(guān)良好，此法測得腺苷的最低檢測限為0.5 nM，低于文獻(xiàn)報(bào)道的其他基于適配體的腺苷檢測方法。該新型CL檢測方法為大量目標(biāo)物提供了新的檢測方法，為臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、藥物分析以及生物醫(yī)學(xué)研究等提供了一個(gè)高效多能的平臺(tái)。
　　 第五章基于分子信標(biāo).金納米粒的端粒酶活性化學(xué)發(fā)光放大檢測技術(shù)
　　 端粒酶是一種與許多腫瘤相關(guān)的敏感性和特異性的腫瘤標(biāo)志物。因此，端粒酶活性的

14、快速、靈敏分析對于腫瘤的檢測以及治療方案功效的評價(jià)顯得至關(guān)重要。本章我們將基于分子信標(biāo)功能化金納米粒(MB-AuNPs)的CL放大技術(shù)應(yīng)用到人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中端粒酶活性的檢測。端粒引物在端粒酶與脫氧三磷酸核苷的作用下復(fù)制得到靶向DNA。將一端可與96孔板上捕獲DNA發(fā)生堿基配對、另一端生物素修飾的分子信標(biāo)偶聯(lián)至鏈霉親和素標(biāo)記的金納米粒上得到MB-AuNPs，此MB-AuNPs上的MB在上述靶向DNA的作用下產(chǎn)生開環(huán)現(xiàn)象，從而將