小鼠骨髓間質干細胞成骨分化及促腎上腺皮質激素的影響.pdf

1、目的:
　　研究小鼠骨髓間質干細胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMMSCs)成骨分化的機理及促腎上腺皮質激素(AdrenocorticotropicHormone,ACTH)對其成骨分化作用的影響。
　　方法:
　　1.取小鼠骨髓間質干細胞(BMMSCs)D1細胞系，作為研究對象。
　　2.實驗分組:
　　第一部分:小鼠BMMSCs成骨分化-實驗分組
　　第1組:對

2、照組1:低糖的細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第2組:低糖的細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA10ug/ml)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第3組:低糖的細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid,AA50ug/ml)+100μg/m

3、l青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第4組:低糖的細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第5組:低糖的細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA10ug/ml)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)+100

4、μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第6組:低糖的細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid,AA50ug/ml)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)
　　第7組:低糖的細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)+1

5、00μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)
　　第8組:低糖的細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid,AA10ug/ml)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)
　　第9組:低糖的細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)+抗

6、壞血酸鈉（AscorbicAcid，AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)
　　第10組:對照組2:標準培養(yǎng)液(低糖細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉（AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)，BM組）
　　第11組:對照組2+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)，成骨OM組
　　第12組:對照

7、組2+p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶抑制劑
　　第13組:成骨OM組（β-gp10mM）+p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶抑制劑
　　第14組:對照組2+JNK氨基末端蛋白激酶抑制劑
　　第15組:成骨OM組(β-gp10mM)+JNK氨基末端蛋白蛋白激酶抑制劑
　　第16組:對照組2+AKT蘇氨酸蛋白激酶抑制劑
　　第17組:成骨OM組（β-gp10mM）+AKT蘇氨酸蛋白激酶抑制劑
　　第二部分

8、:促腎上腺皮質激素對小鼠BMMSCs成骨分化的影響-實驗分組
　　第1組:對照組:標準培養(yǎng)液(低糖細胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AA50ug/ml)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)，BM組）
　　第2組:對照組+促腎上腺皮質激素(ACTH10-8M)
　　第3組:對照組+促腎上腺皮質激素(ACTH10-9M)
　　第4組:對照組+β-甘油磷酸鹽(β-glycerop

9、hosphate，β-gp10mM)，成骨OM組
　　第5組:成骨OM組+促腎上腺皮質激素(ACTH10-8M)
　　第6組:成骨OM組+促腎上腺皮質激素(ACTH10-9M)
　　3.礦化染色:培養(yǎng)小鼠BMMSCs6-7天后，通過ArlizarinRed(茜素紅)染色法評價小鼠BMMSCs骨化程度
　　4.基因表達:培養(yǎng)小鼠BMMSCs1天、3天、6天，然后萃取不同時間細胞中的RNA，然后采用實時定量熒光PCR

10、技術，定量分析成骨相關基因的表達水平及ACTH對其相關基因水平表達的影響。
　　5.蛋白質水平:培養(yǎng)小鼠BMMSCs15分鐘和60分鐘，萃取不同時間細胞中的蛋白質成分，采用蛋白印跡(WesternBlotting)技術，分析成骨分化相關基因的蛋白質表達水平;在加有促腎上腺皮質激素(ACTH10-8M)的成骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)小鼠BMMSCs3天和6天后，萃取不同時間點細胞中的蛋白質成分，采用蛋白印跡(WesternBlotting)技術

11、，分析促腎上腺皮質激素對其成骨分化相關基因蛋白質水平表達的影響。
　　結果:
　　1.小鼠BMMSCs成骨分化:培養(yǎng)細胞6-7天后，AlizarinRed(茜素紅)染色結果顯示:第6組:抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA50ug/ml)+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)骨化程度高于第5組抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA10ug/ml)+β-甘油磷酸鹽(β-glycer

12、ophosphate,β-gp10mM)和第4組β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)不添加抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA)，說明抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA)在小鼠BMMSCs成骨分化過程中有促進的礦化的作用，同時第6組抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA50ug/ml)+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)礦化程度明顯高于第7組β-

13、甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)不添加抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA)和第9組β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA50ug/ml)，說明β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)在成骨分化過程中對成骨的促進作用明顯強于β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM

14、);由第10組到第17組結果顯示:JNK氨基末端蛋白激酶抑制劑和AKT蘇氨酸蛋白激酶抑制劑促進成骨分化，p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶抑制劑抑制成骨分化;在相關基因蛋白表達水平，促進成骨的組中15分鐘，60分鐘的Runx2，p-p38，BSP,p-AKT的表達有明顯的改變。
　　2.促腎上腺皮質激素(ACTH)對小鼠BMMSCs成骨分化的影響:促腎上腺皮質激素(ACTH10-8M)對礦化有明顯的抑制作用，而促腎上腺皮質激素(AC

15、TH10-9M)對礦化作用影響不明顯;促腎上腺皮質激素(ACTH10-8M)對成骨基因Runx2、黑色素3蛋白受體(MC3R)及血管內皮生長因子(VEGFa)的表達水平具有抑制作用，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，促腎上腺皮質激素(ACTH10-9M)對成骨基因Runx2、黑色素3蛋白受體(MC3R)及血管內皮生長因子(VEGFa)的表達水平作用不明顯，無統(tǒng)計學意義;而在加有促腎上腺皮質激素(ACTH10-8M)的組中，Runx2、BSP

16、和P-P38的蛋白質表達水平有下降的趨勢。
　　結論:
　　1.在小鼠BMMSCs成骨分化過程中，抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA50ug/ml)和β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)有促進成骨分化作用，包括促進礦化和在基因水平和蛋白水平對成骨特異性轉錄因子Runx2有明顯的促進作用。
　　2.促腎上腺皮質激素(ACTH10-8M)對小鼠BMMSCs成骨分化有抑制作用，而且