DHBV侵染規(guī)律和preS蛋白原核表達(dá)及在評(píng)價(jià)抗人類乙肝新藥的應(yīng)用.pdf

1、本研究的創(chuàng)新點(diǎn) 1.從四川麻鴨分離到三株鴨乙型肝炎病毒(DHBV)，全基因組均含3006個(gè)核苷酸(GenBank登錄號(hào)EU429324，EU429325，EU429326)，具有X-like開(kāi)放閱讀框特征。 2.對(duì)DHBVpreS基因進(jìn)行原核表達(dá)并獲得純化preS重組蛋白及其多克隆抗體。 3.建立檢測(cè)DHBV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)和基于preS重組蛋白的免疫組化法，并結(jié)合組織學(xué)和血液生化指標(biāo)對(duì)DHB

2、V在感染鴨體模型侵染規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)觀察，建立起抗人類乙型肝炎新藥體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)的技術(shù)平臺(tái)。 4.對(duì)新研制藥物(代號(hào)PNA)在體外細(xì)胞抗人類乙型肝炎病毒(HBV)活性及體內(nèi)的抗DHBV活性檢測(cè)結(jié)果為其進(jìn)一步臨床前研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 鴨乙型肝炎病毒(DuckHepatitisBVirus，DHBV)與乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)同屬嗜肝DNA病毒科，這類病毒的特征是有強(qiáng)的嗜肝細(xì)胞特性，在病毒形態(tài)

3、、基因組結(jié)構(gòu)、復(fù)制過(guò)程等生物學(xué)特性相似。DHBV感染鴨模型是研究HBV的生物學(xué)特性、致病機(jī)制和抗HBV藥物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。本文通過(guò)調(diào)查四川地區(qū)麻鴨自然攜帶DHBV的情況，分離DHBV毒株，以此毒株為模板，擴(kuò)增主要抗原基因preS。通過(guò)構(gòu)建DHBV-preS原核表達(dá)質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達(dá)，從而對(duì)表達(dá)蛋白免疫原性、表達(dá)蛋白抗體介導(dǎo)的免疫組化檢測(cè)人工感染DHBV后在體內(nèi)的蛋白定位分析與侵染規(guī)律，以期系統(tǒng)地了解的入侵方式和復(fù)制機(jī)理，為闡明DHBV的發(fā)病

4、機(jī)制提供關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)建立基于定量檢測(cè)DHBV的FQ-PCR方法，用于DHBV疾病模型研究，并結(jié)合體外模型HepG2.2.15細(xì)胞研究抗乙型肝炎新藥，結(jié)果如下： DHBV毒株的分離及分子特征解析結(jié)果表明：四川麻鴨自然攜帶DHBV4％，證實(shí)四川麻鴨是研究實(shí)驗(yàn)性DHBV感染動(dòng)物模型的良好鴨種；對(duì)分離到的其中3株DHBV陽(yáng)性血清全基因克隆、測(cè)序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)全基因組均含3006個(gè)核苷酸(GenBank登錄號(hào)EH429

5、324，EU429325，EU429326)，具有X-like開(kāi)放閱讀框特征；進(jìn)一步研究ORF-S還表明該基因編碼33個(gè)氨基酸，有四個(gè)疏水區(qū)，無(wú)N-糖基化位點(diǎn)，也無(wú)豆蔻?；稽c(diǎn)，在1～30aa內(nèi)有一個(gè)明顯的信號(hào)肽，在19～20aa處有斷點(diǎn)，跨膜螺旋預(yù)測(cè)為外膜蛋白，抗原位點(diǎn)主要分布于preS區(qū)氨基酸序列中。 根據(jù)DHBV-preS序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以分離的DHBV毒株為模板擴(kuò)增目標(biāo)基因并將其克隆至pMD18-T載體，經(jīng)PC

6、R、酶切和DNA測(cè)序鑒定后，將DHBV-preS基因正向插入原核表達(dá)載體pET-32a(+)的ApaI和NcoI位點(diǎn)間，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/DHBV-preS。重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/DHBV-preS轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)，能表達(dá)出了大小約為37kD的preS重組蛋白，與預(yù)期表達(dá)蛋白分子量大小相符；經(jīng)對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)劑IPTG濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定重組質(zhì)粒pET32a(+)

7、/DHBV-preS的最佳誘導(dǎo)條件為0.8mmol/LIPTG、37℃條件下誘導(dǎo)4h。表達(dá)產(chǎn)物用鎳柱親和層析純化后，將得到的preS重組蛋白做梯度稀釋，初步建立ELISA檢測(cè)DHBsAb的方法(間接法);同時(shí)將純化的重組蛋白與等量弗氏佐劑混合制備preS重組蛋白免疫原，四次免疫家兔，獲得的兔抗DHBV-preS高免血清經(jīng)辛酸-硫酸銨粗提后，陰離子交換柱層析純化抗體IgG。 建立DHBV-preS基因表達(dá)蛋白抗體介導(dǎo)的免疫組化方法

8、;針對(duì)DHBV的保守序列設(shè)計(jì)并合成引物及熒光標(biāo)記探針，建立實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorsescencequantitativepolymerasechainreaction，F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)方法。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值(cyclethreshold，Ct值)與模板濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.993，將其檢測(cè)極限的Ct值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成拷貝數(shù)約為5copies/L，未檢測(cè)到鴨病毒性肝炎、鴨瘟病毒、鴨源致病性大腸埃希氏

9、菌、鴨源致病性沙門(mén)氏菌、鴨疫里默氏桿菌，表明FQ-PCR檢測(cè)DHBV方法靈敏、特異性強(qiáng)。 采用鴨乙型肝炎病毒人工方法感染1日齡四川麻鴨，攻毒后于不同時(shí)間采血分離血清，采集肝臟、胰腺、腎臟、脾臟等組織或器官，經(jīng)建立的DHBV-preS基因表達(dá)蛋白抗體免疫組化方法和FQ-PCR方法檢測(cè)DHBV在感染鴨體內(nèi)侵染過(guò)程與定位分布，并結(jié)合組織學(xué)和血液生化指標(biāo)對(duì)DHBV在感染鴨體模型侵染規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)觀察。結(jié)果顯示：感染后2d可在血清和肝組織中

10、檢測(cè)出DHBVDNA，血清中DHBVDNA從感染后第10d～30dDHBVDNA的拷貝數(shù)保持在1.00E+09以上，肝組織中DHBVDNA的含量從感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上；肝臟DHBVDNA第14d達(dá)到最高水平，而血清中DHBVDNA第22d達(dá)到最高水平。肝臟、胰腺、腎臟、脾臟的損傷程度與DHBVDNA水平成正相關(guān)；在感染后3～52d內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)從肝臟、胰腺、腎臟、脾臟及大腦六種組織器官中檢測(cè)出DHBsAg，DH

11、BsAg主要分布在細(xì)胞漿，少部分分布于細(xì)胞核，未能從食道、腺胃、肺、心臟、生殖器和肌肉中檢測(cè)到DHBsAg，表明DHBV嗜肝的同時(shí)具有泛嗜性，且在靶器官的侵染與分布具有一定選擇性；在感染后1～3d、52d以后各組織相繼不能檢出DHBsAg，感染后12～31d病毒在機(jī)體內(nèi)各組織的分布最為廣泛，感染后4d肝臟開(kāi)始出現(xiàn)DHBsAg陽(yáng)性細(xì)胞，感染后6d腎臟、胰腺、脾臟相繼開(kāi)始出現(xiàn)DHBsAg陽(yáng)性細(xì)胞，而腦組織在感染后10d出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞；肝臟的檢

12、出率最高，持續(xù)至52d，大腦的檢出率最低，分析表明該蛋白可能是膜蛋白,具有運(yùn)輸核漿與引導(dǎo)病毒組分進(jìn)入核內(nèi)參與病毒復(fù)制的功能。DHBV感染后第4d，總蛋白和自蛋白含量開(kāi)始降低，谷丙、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性升高(P＜0.01)，乳酸脫氫酶活性升高(P＜0.01)，肌酐和尿素有變化但無(wú)規(guī)律，表現(xiàn)為升高趨勢(shì)，感染后44d開(kāi)始，各項(xiàng)血液生化指標(biāo)逐漸趨于正常值，表明DHBV引起肝臟損傷的同時(shí)累及腎臟。 在建立的抗人類乙型肝炎新藥體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)的技術(shù)平

13、臺(tái)和體外模型HepG2.2.15上評(píng)價(jià)抗乙型肝炎新研制藥物-核苷類似物(代號(hào)_PNA)的作用。在HepG2.2.15細(xì)胞系中，PNA有明確的抑制HBVDNA復(fù)制作用，抑制HasAg和HBeAg，在7.8～62.5μg/mL劑量范圍內(nèi)有劑量-時(shí)間依賴關(guān)系，未見(jiàn)到明顯細(xì)胞學(xué)毒性;在鴨乙肝動(dòng)物模型中,PNA對(duì)DHBVDNA抑制率達(dá)50％的最低用藥劑量為口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kgPNA對(duì)DHBV的抑制率與拉米夫定口服