利用RNAi技術(shù)探討酸感受離子通道（ASICs）的特性.pdf

1、酸感受離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是H<'+>門控的陽離子通道，在胞外H<'+>濃度增高時激活開放，胞外Na<'+>通過其開放的通道進入胞內(nèi)，導致細胞去極化興奮。ASICs通道屬于表皮鈉通道/退化因子基因(ENaC/DEG，epithelialsodium channel/degenerin gene)超家族的一員，到目前為止，已克隆了由4個基因編碼的6個不同亞基，它們分別是：ASIC1a，

2、ASIC1b，ASIC2a，ASIC2b，ASIC3和ASIC4。其中，ASIC1a是一個很重要的亞基，它在突觸傳遞及其可塑性的調(diào)節(jié)、空間學習記憶、長時程增強(LTP)、痛覺傳導和缺血性腦損傷等生理和病理活動中起重要作用。組織酸化是一個很常見的病理現(xiàn)象，如腦卒中，癲癇發(fā)作，炎癥，腫瘤組織和代謝異常等都會引起局部組織的酸化進而組織損傷。以往實驗結(jié)果表明ASIC1a參與了酸化誘導神經(jīng)元損傷的過程，在電壓門控性Ca<'2+>通道和谷氨酸受體阻

3、斷劑存在的情況下，ASIC1a激活隨之胞內(nèi)Ca<'2+>超載能引起時間依賴的神經(jīng)損傷，并可被ASIC1a特異性阻斷劑(PcTX1)或降低胞外Ca<'2+>所抑制。為了進一步探索抑制ASICs與酸化誘導損傷的關(guān)系，本研究采用了以ASIC1a基因為靶點的RNAi(RNA interference)技術(shù)，旨在觀察敲減ASIC1a亞基表達后可能的抗酸性神經(jīng)保護作用。 本實驗首先通過RT-PCR法確證了ASICs各亞基在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6

4、細胞，大鼠海馬神經(jīng)元和DRG神經(jīng)元中的表達。然后利用RNAi技術(shù)構(gòu)建了針對ASIC1a和ASIC2a亞基的shRNA表達載體，經(jīng)western blotting篩選出有效的干擾質(zhì)粒。隨后建立了穩(wěn)定敲減ASIC1a表達的細胞株和穩(wěn)定陰性對照細胞株，經(jīng)半定量RT-PCR和western blotting證實了穩(wěn)定株中ASIC1a的敲減效果。 通過繪制細胞生長曲線和測集落形成率的實驗發(fā)現(xiàn)：抑制ASIC1a亞基的表達未改變正常情況下細胞

5、的生長增殖情況。通過MTT實驗和LDH釋放實驗發(fā)現(xiàn)在不同酸性條件下(pH6.0，pH6.5，pH6.9)抑制ASIC1a亞基的表達能顯著減輕酸化誘導的損傷反應：細胞存活數(shù)目明顯增多，生存狀態(tài)也有所改善。LDH釋放實驗發(fā)現(xiàn)在大鼠海馬神經(jīng)元上轉(zhuǎn)染pshRNA1a2干擾質(zhì)粒抑制ASIC1a亞基表達后，能顯著減輕pH6.0酸性條件下神經(jīng)元的損傷，這與C6細胞上得到的實驗結(jié)果相一致。 為了探索ASIC1a亞基的敲減是否是細胞抗酸性損傷的主

6、要原因，在實驗中我們對比了加入氨氯吡咪(amiloride)與抑制ASIC1a亞基表達對pH6.0損傷保護作用的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：它們的保護作用相當，差異無顯著性意義。為了初探C6細胞上抑制ASIC1a亞基表達抗酸性損傷的機制，首先證明了C6細胞上有可通透Ca<'2+>的被酸激活的通道，然后比較了在pH6.0條件下胞外Ca<'2+>從0.2mM上升到1.3mM時對shRNA1a2(2)和shNEG細胞的影響。結(jié)果顯示，酸化能引起兩組細胞的