成球培養(yǎng)和以Cr-1為標志物分離鑒定食管癌干細胞的研究.pdf

1、目的：運用無血清成球培養(yǎng)法和以Cripto-1(CR-1)為表面標志物從人食管鱗癌(Esophageal sequamous carcinoma cells,ESCCs)細胞系中分離/富集腫瘤干細胞,并對其“干性”特性進行鑒定。
　　方法：1.EC109細胞于添加1×B27的無血清干細胞培養(yǎng)基(DMEM/F121:1)和poly-Hema包被的培養(yǎng)皿或低黏附培養(yǎng)板中培養(yǎng),獲取細胞球。采用實時定量PCR方法檢測干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達

2、,以連續(xù)傳代和平板克隆形成實驗評價其自我更新能力,免疫熒光細胞化學法檢測其分化前后干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和分化標志物的表達變化,并用裸鼠移植瘤實驗檢測其體內(nèi)成瘤能力。2.以免疫組化方法檢測臨床標本上CR-1的表達與臨床病例參數(shù)及臨床預(yù)后的關(guān)系,確定CR-1在ESCCs中表達的意義。然后將CR-1作為ESCCs腫瘤干細胞候選標志物,用流式細胞儀從EC-109和TE-1細胞中分選出CR-1HIGH和CR-1LOW兩個細胞亞群,比較兩個細胞亞群在干

3、性基因表達、平板克隆形成能力和體外侵襲能力上的差異。采用RNA干擾技術(shù)沉默CR-1表達后,觀察EC109和TE-1細胞成瘤能力的改變。
　　結(jié)果：1.在優(yōu)化的無血清成球培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)5天能獲得EC109細胞的細胞球。細胞球細胞高表達Sox2等干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,具有自我更新能力、分化潛能。裸鼠體內(nèi)1×104個細胞球細胞能啟動腫瘤形成,而單層培養(yǎng)細胞則需要1×105個細胞,且同數(shù)量級的細胞球細胞較單層培養(yǎng)細胞所形成的腫瘤體積大。2.

4、ESCC組織表達CR-1,且與侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(p=0.023和0.032),與病人生存時間呈負相關(guān)(p﹤0.001)。EC-109和TE-1細胞系均表達CR-1,流式分選結(jié)果顯示兩個細胞系中CR-1HIGH細胞亞群比例分別為2.27％和1.96%。CR-1HIGH細胞亞群的干性基因表達、平板克隆形成能力和體外侵襲能力均顯著強于CR-1LOW者。沉默CR-1表達后,成瘤能力顯著降低。
　　結(jié)論：1.無血清成球培養(yǎng)法能從