熱脅迫下番茄多胺代謝與基因差異表達分析.pdf

1、番茄屬于喜溫性蔬菜作物,最適溫度范圍為20-25℃,適應溫度范圍為15-33℃.但在生產(chǎn)中周圍的環(huán)境溫度往往會超過這一溫度范圍,達到35℃以上,甚至超過40℃.高溫脅迫成為番茄生產(chǎn)中產(chǎn)量和品質(zhì)提高的主要限制因素之一.研究番茄耐熱性形成的生理和分子生物學基礎對于番茄耐熱育種以及建立提高番茄耐熱能力的栽培技術都具有重要的意義.日益增多的研究表明,多胺與植物的抗逆性密切相關.本研究重點探討番茄耐熱性與多胺代謝之間的關系和進行耐熱性相關基因的克

2、隆,為建立高效、可靠的番茄耐熱性鑒定、評價方法以及進行番茄耐熱分子生物學方面的研究提供依據(jù),主要研究成果如下: 1.利用染色體步行法,從已知DNA序列克隆側翼未知序列是非常有效的方法之一.本研究對連接介導PCR(LM-PCR)進行了改良,包括以下步驟:1)多酶切位點接頭的設計; 2)接頭和基因組DNA的酶切連接;3)利用基因特異性引物和錨定引物進行巢式PCR,獲取步移片斷.使用該技術成功獲得了番茄S-腺苷蛋氨酸脫羧酶基因1(S-

3、adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)轉錄起始位點上游879bp的調(diào)控序列. 2.以蔓陀羅SAMDC全長cDNA序列(Genbank登錄號:Y07768)為信息探針,篩選NCBI番茄EST數(shù)據(jù)庫,依據(jù)若干同源EST信息,經(jīng)人工拼接、RT-PCR及RACE技術,獲得了一個新的番茄SAMDC基因家族成員,命名為SLSAMDC1(Genbank登錄號:EF550528),并利用染色體步移技術克隆

4、了SLSAMDC1 879bp的上游調(diào)控區(qū)域..SLSAMDCl基因cDNA序列全長1847bp,5'非翻譯區(qū)和3'非翻譯區(qū)分別長523bp、241bp;存在3個ORF(tiny uORF、small uORF和main ORF),其中main ORF編碼360個氨基酸的SAMDC酶原;SLSAMDC1基因組序列全長3648bp,含有3個內(nèi)含子,均位于5'非翻譯區(qū),所有內(nèi)含子的剪切位點均符合真核生物GT-AG規(guī)則.SLSAMDC1基因與

5、其它植物來源SAMDC基因同源性較高(48﹪-96﹪),與番茄已克隆SAMDC基因BT013281、BT013882的氨基酸同源性分別為66﹪和77﹪,與人、大腸桿菌以及酵母的同源性較低(30﹪、25﹪和lO﹪).Southern雜交表明,SLSAMDC1在番茄基因組中以單拷貝存在.表達譜分析發(fā)現(xiàn),SLSAMDC1基因在番茄根、莖、葉、花蕾、果實等器官中均表達,果實中的表達量稍高.生物信息學分析表明,SLSMDC1基因轉錄起始位點上游序

6、列存在多個順式作用元件,如W-Box、TATA-box、CAAT-box等. 3.研究了高溫脅迫對耐熱品系Saladette和熱敏品系中蔬6號多胺代謝和光合作用的影響.耐熱性不同番茄品系,經(jīng)過24小時高溫處理后(40/30℃),凈光合速率都受到了影響,但下降的程度相差很大.耐熱品系Saladette凈光合效率下降32﹪,而熱敏品系中蔬6號則下降了63﹪.高溫處理后,Saladette和中蔬6號多胺含量均上升,前者的上升幅度大于后

7、者,亞精胺含量增加的差異是主要原因.熱脅迫下,SAMDC基因和ADC基因的轉錄均受到不同程度的抑制.亞精胺預處理可以有效減輕高溫脅迫對光合作用的抑制作用,且對于熱敏性番茄更為有效. 4.應用cDNA-AFLP方法,以番茄幼苗為研究對象,對高溫脅迫下番茄葉片的基因表達進行了mRNA指紋分析.通過768對引物組合的篩選,共分離了187個差異表達的TDF,并對其中47個TDF進行了克隆、測序和序列分析.結果表明:35個TDF與已知序列

8、同源(E-Value<10<'-10>),功能涉及信號傳導、轉錄調(diào)控以及細胞自救或防御等.另有12個TDF無同源序列或同源性低.5.獲得了番茄葉片熱誘導基因HSP70基因(SLHSP70)的全長cDNA序列和HSP90基因(SLHSP90)的cDNA序列的3'端.SLHSP70全長2415bp,編碼692個氨基酸,與定位于葉綠體的HSP70有較高的同源性,結合分子進化和保守域分析,推測SLHSP70編碼產(chǎn)物定位于質(zhì)體.已獲得的SLHSP