抗雙向情感障礙藥長(zhǎng)期作用通過(guò)下調(diào)TRPC1表達(dá)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+依賴(lài)的谷氨酸釋放.pdf

1、前言：
　　雙向情感障礙(Bipolar disorder，BPD)是一種嚴(yán)重的精神系統(tǒng)疾病，全球發(fā)病率約為2-5％。以疾病的躁狂期和抑郁期反復(fù)出現(xiàn)為主要特征，患者不僅表現(xiàn)為情緒紊亂，如情感高漲或低落，也伴有相應(yīng)認(rèn)知、行為以及生理節(jié)律的改變，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，是一種受遺傳和環(huán)境影響的疾病。
　　谷氨酸是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間信息傳遞的重要神經(jīng)遞質(zhì)，是增強(qiáng)神經(jīng)元突觸可塑性和細(xì)胞活力的主要因素，目前大量研究證明谷氨酸系統(tǒng)在情感障

2、礙的調(diào)解中起重要作用，已成為BPD發(fā)病及藥物治療研究的新熱點(diǎn)。谷氨酸不僅在腦的發(fā)育、神經(jīng)元的分化遷移、軸突形成中起重要作用，還參與調(diào)節(jié)腦的高級(jí)功能，如突觸可塑性、學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知等，對(duì)BPD死亡患者腦組織研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸表達(dá)異常增高，應(yīng)用MRI檢測(cè)結(jié)果也顯示BPD患者躁狂期腦內(nèi)谷氨酸系統(tǒng)活性增高，此外一些研究資料顯示應(yīng)用作用于谷氨酸系統(tǒng)的藥物如利魯唑、氯胺酮、拉莫三嗪等具有抗BPD作用，因此探明谷氨酸系統(tǒng)在BPD發(fā)病中的作用對(duì)疾病的治療具

3、有重要意義。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞是谷氨酸的攝取、代謝和循環(huán)的主要場(chǎng)所，最新的研究認(rèn)為BPD患者腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙是引起谷氨酸異常的主要原因。神經(jīng)元缺乏丙酮酸羧化酶和谷氨酰胺合成酶，自身不能合成谷氨酸和谷氨酰胺，星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要功能是合成谷氨酰胺并轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)元。突觸間隙低濃度的谷氨酸對(duì)興奮性的傳遞十分重要，星形膠質(zhì)細(xì)胞另一個(gè)重要功能就是清除細(xì)胞外過(guò)多的谷氨酸，將谷氨酸從胞外逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，終止突觸部位谷氨酸的興奮性傳遞，

4、此外星形膠質(zhì)細(xì)胞本身也可釋放谷氨酸，與神經(jīng)元之間進(jìn)行信息傳遞，谷氨酸釋放水平發(fā)生改變將會(huì)嚴(yán)重影響其與神經(jīng)元之間的這種雙向、密切的信息交流，并導(dǎo)致各種疾病狀態(tài)的產(chǎn)生。在BPD患者腦內(nèi)已發(fā)現(xiàn)谷氨酸表達(dá)異常伴隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的丟失，雖然腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常改變?cè)贐PD發(fā)病過(guò)程中所起的具體作用仍不清楚，但研究資料顯示其功能障及引起的谷氨酸代謝改變可能是導(dǎo)致BPD的主要原因，目前已成為BPD病理生理機(jī)制研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞

5、可通過(guò)多種方式釋放谷氨酸，但病理狀態(tài)下Ca2+依賴(lài)的方式是其釋放的主要機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)Ca2+來(lái)源主要依賴(lài)于細(xì)胞外Ca2+通道內(nèi)流以及胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)池釋放這兩條途徑，研究表明細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)池釋放是引起谷氨酸釋放的主要因素。在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在兩種功能性的Ca2+儲(chǔ)池，IP3敏感性Ca2+儲(chǔ)池和Ryanodine敏感性Ca2+儲(chǔ)池，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)池釋放后可通過(guò)激活細(xì)胞膜上瞬時(shí)受體電位通道(TRPC)，引起胞外Ca2+內(nèi)流補(bǔ)充胞內(nèi)Ca

6、2+損失，已證實(shí)TRPC是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)濃度的主要通道。
　　目前使用的抗BPD藥物在臨床上均不能取得較好的療效，特別是在患者抑郁期的治療，有相當(dāng)比例的患者即使全療程服用不同的藥物也不能取得療效，而開(kāi)發(fā)更加有效的治療藥物所面臨的主要困難就是對(duì)疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)尚不清楚。可溶性鋰鹽、丙戊酸鈉和卡馬西平是目前治療雙相精神障礙的常用藥，三種藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)均無(wú)相似之處，臨床上在BPD的躁狂期能引起較好的療效，但是這些藥物發(fā)揮療效的確

7、切藥理機(jī)制目前尚未闡明，研究藥物潛在的共同作用機(jī)制是探尋新的藥物治療策略的有效途徑。有研究顯示大鼠給予鋰鹽和丙戊酸鈉慢性處理兩周能明顯降低腦內(nèi)谷氨酸含量，卡馬西平慢性作用也能降低高K+誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)末梢谷氨酸的釋放，我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究證明三種藥物長(zhǎng)期作用可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞堿化，抑制細(xì)胞對(duì)肌醇的攝取，也能上調(diào)細(xì)胞cPLA2表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞谷氨酸受體GluK2亞型的表達(dá)，提示三種藥物可能對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+及Ca2+依賴(lài)的谷氨酸釋放

8、具有調(diào)節(jié)作用，本課題采用原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞方法，觀察鋰鹽、丙戊酸鈉和卡馬西平長(zhǎng)期作用對(duì)細(xì)胞外高K+刺激誘發(fā)的谷氨酸釋放的抑制作用并探討其作用機(jī)制，為BPD的藥物治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　取新生小鼠大腦皮質(zhì)進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)，加入雙丁酰環(huán)腺苷酸(dBcAMP)作用1周促進(jìn)細(xì)胞分化成熟。分別加入用碳酸鋰(Li2CO3)、丙戊酸鈉(VPA)、卡馬西平(CBZ)長(zhǎng)期作用細(xì)胞2周，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):①用高效液相色譜法檢測(cè)

9、細(xì)胞外高K+刺激引起的谷氨酸釋放量。②細(xì)胞用熒光探針染料Fura-2負(fù)載，奧林巴斯活細(xì)胞熒光顯微鏡下檢測(cè)三種抗抑郁藥慢性作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存釋放功能的影響。③RT-PCR法檢檢測(cè)三種抗抑郁藥長(zhǎng)期處理對(duì)細(xì)胞TRPC1mRNA表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-wayANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、三種抗BPD藥物長(zhǎng)期

10、作用2周對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的抑制作用
　　培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)用PBS緩沖液刺激時(shí)只釋放基礎(chǔ)量的谷氨酸，當(dāng)換成45 mM高K+緩沖液刺激后，能促發(fā)2-5倍谷氨酸釋放的增加，當(dāng)再次應(yīng)用PBS緩沖液刺激后，谷氨酸釋放量又回復(fù)基礎(chǔ)釋放量。成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用Li2CO3(0.25、0.5、1 mM)、CBZ(25μM、50μM)和VPA(100μM、1mM)作用2周對(duì)谷氨酸基礎(chǔ)釋放量沒(méi)有影響，但不同濃度的三種藥物均可明顯抑

11、制高K+緩沖液引起的谷氨酸釋放量的增加，表現(xiàn)為與對(duì)照組細(xì)胞相比，第6、7、8、9、10 min谷氨酸釋放量明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、細(xì)胞外高K+刺激可通過(guò)外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放引起星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加
　　培養(yǎng)于蓋玻片上成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞用Fura-2處理后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)Ca2+測(cè)定，用340 nm與380 nm的熒光比值(F340/F380)表示細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)果顯示細(xì)胞應(yīng)用45mMK+刺激

12、能持久引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，分別應(yīng)用L-型電壓依賴(lài)鈣通道抑制劑Nifedipine和RyR抑制劑Ryanodine后均可抑制45mMK引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，細(xì)胞膜Na+-Ca2+交換抑制劑KB-R7943對(duì)45mMK+刺激引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加無(wú)影響。
　　3、三種抗BPD藥物長(zhǎng)期作用可抑制45 mM K引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高的水平和持續(xù)時(shí)間
　　細(xì)胞應(yīng)用45mMK刺激能持久引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加

13、，應(yīng)用Li2CO3、CBZ、VPA作用2周后的星形膠質(zhì)細(xì)胞給予45 mM K+刺激后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加幅度降低，且很快恢復(fù)正常，表現(xiàn)為高K+刺激后第3、5、7、9、11 min的熒光比值較對(duì)照組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、三種抗雙相BPD藥物長(zhǎng)期作用可抑制Adenophostin A(AdA)引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加
　　AdA是IP3R的激動(dòng)劑，IP3R是IP3依賴(lài)的Ca2+通道，激動(dòng)IP3R能

14、引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存Ca2+的釋放。應(yīng)用Li2CO3、CBZ和VPA作用2周后能明顯抑制AdA刺激引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，取激動(dòng)劑刺激后3個(gè)循環(huán)的熒光比值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組細(xì)胞相比，三種藥物長(zhǎng)期作用組細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加幅度明顯降低。
　　5、三種抗雙相BPD藥物長(zhǎng)期作用可抑制4-Chloro-M-Cresol(4-CMC)引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加
　　4-CMC是RyR的激動(dòng)劑，RyR是Ca2+依賴(lài)的Ca2+

15、通道，激動(dòng)RyR能引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存Ca2+的釋放。應(yīng)用Li2CO3、CBZ、VPA作用2周后能明顯抑制4-CMC刺激引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，取激動(dòng)劑刺激后5個(gè)循環(huán)的熒光比值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組細(xì)胞相比，三種藥物長(zhǎng)期作用組細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加水平明顯降低。
　　6、三種抗BPD藥物長(zhǎng)期作用可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+再充功能
　　Thapsigargin是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+-ATP酶的抑制劑，將細(xì)胞加入Thapsig

16、argin作用10 min，耗竭星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+，再重新加入CaCl2后，Li2CO3、CBZ、VPA作用2周能明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+再充功能。取加入CaCl2后的2 min內(nèi)的熒光比值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組細(xì)胞相比，三種藥物長(zhǎng)期作用組細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加水平明顯降低。
　　7、三種抗雙相BPD藥物長(zhǎng)期作用可抑制TRPC1 mRNA表達(dá)
　　RT-PCR結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用Li2CO3、CBZ、VP

17、A作用2周后TRPC1mRNA表達(dá)較對(duì)照組細(xì)胞明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　討論：
　　谷氨酸是星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的與神經(jīng)元之間進(jìn)行雙向信息傳遞的重要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，是增強(qiáng)神經(jīng)元突觸可塑性和細(xì)胞活力的主要因素，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Li+、CBZ、VPA長(zhǎng)期作用能抑制高K+引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放。目前雖然谷氨酸在BPD發(fā)病中的機(jī)制還不清楚，但一些研究資料預(yù)示谷氨酸信號(hào)通路在BPD患者躁狂期增強(qiáng)而在抑郁期減弱，如應(yīng)用MRI檢

18、測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPD患者躁狂期腦內(nèi)谷氨酸系統(tǒng)活性增高，對(duì)BPD死亡患者腦組織進(jìn)行特異性染色發(fā)現(xiàn)谷氨酸活性增高伴隨著大腦海馬苔狀纖維過(guò)渡生長(zhǎng)，而臨床治療中BPD患者抑郁期采用利魯唑和氯胺酮可產(chǎn)生較好的療效，研究表明利魯唑不僅能增強(qiáng)Na+依賴(lài)的谷氨酸攝取，也能引起星形膠質(zhì)細(xì)胞Na+-Ca2+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流進(jìn)而引起谷氨酸遞質(zhì)釋放，在BPD的抑郁期增加患者腦內(nèi)谷氨酰胺/谷氨酸的比率，減輕抑郁癥狀，氯胺酮在半麻醉劑量使用，具有快速抗抑郁作

19、用，研究認(rèn)為這與增強(qiáng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸-谷氨酰胺代謝循環(huán)相關(guān)。Li+、CBZ、VPA在臨床使用中均在BPD的躁狂期具有較好療效，而在抑郁期治療效果不如利魯唑、拉莫三嗪等其他藥物，本研究結(jié)果與三種藥物在BPD臨床治療中所觀察到的現(xiàn)象一致，此外臨床上也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期服用Li+制劑維持治療時(shí)可加重BPD患者抑郁期的癥狀，這可能也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果所顯示的Li+長(zhǎng)期作用對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的抑制有關(guān)，因此這些研究提示谷氨酸鹽的平衡可能在BPD發(fā)

20、病中起到重要作用，尋找調(diào)節(jié)谷氨酸系統(tǒng)的特效藥物可能在BPD治療中具有重要意義。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞在病理狀態(tài)下通過(guò)Ca2+依賴(lài)的方式釋放谷氨酸，研究報(bào)道BPD患者躁狂期細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平明顯高于正常人，而在BPD抑郁期或無(wú)癥狀期患者細(xì)胞內(nèi)Ca2+無(wú)明顯變化，這與發(fā)現(xiàn)的BPD患者躁狂期腦內(nèi)谷氨酸系統(tǒng)活性增高相一致。本研究發(fā)現(xiàn)三種抗BPD藥物長(zhǎng)期作用能明顯抑制細(xì)胞外高K+引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加。高K+可通過(guò)激活電壓依賴(lài)性Ca2+通道和

21、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)池釋放兩種方式增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+，但研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存Ca2+釋放是引起谷氨酸釋放主要原因，如Hua等用機(jī)械刺激激活星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上電壓依賴(lài)性Ca2+通道，進(jìn)而引起Ca2+依賴(lài)的谷氨酸釋放，但在應(yīng)用IP3R和RyR拮抗劑后，機(jī)械刺激引起的谷氨酸釋放明顯被抑制，本實(shí)驗(yàn)中在進(jìn)一步應(yīng)用IP3R和RyR激動(dòng)劑后細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加也被抑制，這提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)池再充功能可能被抑制，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放后TRPC是Ca2+

22、再充的主要通道，在星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿膜上主要表達(dá)TRPC1，本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用Ca2+-ATP酶抑制劑Thapsigargin耗竭細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+后，在細(xì)胞外重新加入2mM CaCl2，也僅能部分引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)三種抗BPD藥物均能明顯下調(diào)細(xì)胞TRPC1mRNA的表達(dá)，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)抑制Ca2+的再充功能是三種抗BPD抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+的機(jī)制之一。此外我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究顯示三種藥物長(zhǎng)期給藥可通過(guò)使星形膠質(zhì)細(xì)胞堿

23、化，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)肌醇的攝取，并上調(diào)細(xì)胞cPLA2表達(dá)。抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)肌醇的攝取可減少I(mǎi)P3產(chǎn)生以及引起的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+的釋放，cPLA2表達(dá)與花生四烯酸的代謝有關(guān)，研究表明花生四烯酸以復(fù)雜的方式干擾細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度。我們之前的研究也顯示三種藥物長(zhǎng)期給藥也能下調(diào)細(xì)胞谷氨酸受體GluK2受亞型的表達(dá)。應(yīng)用GluK2的拮抗劑NS102或?qū)?yīng)用siRNA將GluK2基因沉默后均能明顯抑制谷氨酸引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，進(jìn)一

24、步研究發(fā)現(xiàn)GluK2受體與磷脂酶C相關(guān)聯(lián)的，可通過(guò)調(diào)節(jié)IP3表達(dá)影響細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+的釋放。
　　綜上所述，本研究所使用的三種抗雙向情感障礙藥物可通過(guò)抑制肌醇攝取、上調(diào)細(xì)胞cPLA2表達(dá)、下調(diào)GluK2及TRPC1表達(dá)多個(gè)環(huán)節(jié)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，進(jìn)而抑制細(xì)胞Ca2+依賴(lài)的谷氨酸釋放，這可能是藥物治療BPD的潛在作用機(jī)制之一。本研究結(jié)果從離體水平上為抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放在抗BPD治療中的作用提供了一定的理論依據(jù)

25、，但星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸在突觸前神經(jīng)元、突觸后神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間進(jìn)行興奮性傳遞是一種復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，應(yīng)用MRI技術(shù)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)谷氨酸-谷氨酰胺在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞代謝循環(huán)中是一種動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程，因此BPD患者谷氨酸調(diào)節(jié)功能機(jī)制的失常遠(yuǎn)比觀察到的遞質(zhì)改變復(fù)雜，因此探明谷氨酸系統(tǒng)在BPD發(fā)病中的作用從而開(kāi)發(fā)出更有效的治療藥物還需大量的深入研究。
　　結(jié)論：
　　1、Li2CO3、VPA和CBZ三種抗雙相精神障礙藥物長(zhǎng)期作用均能抑制