鈣離子-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱγ(CaMKⅡγ)體內(nèi)外促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：結(jié)直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO的GLOBOCAN2008數(shù)據(jù)顯示，在世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌已經(jīng)成為第四大常見腫瘤。2008年的新發(fā)病例大約有一百二十萬，死亡病例有六十萬。在中國，根據(jù)GLOBOCAN2008的數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌在男性和女性中均為第五大常見惡性腫瘤，死亡率也在所有惡性腫瘤中排第五位。盡管對于結(jié)直腸癌的治療已經(jīng)有了很大的進(jìn)步，放射治療和化學(xué)治療也越來越普遍，但是對于發(fā)生了局部浸潤和轉(zhuǎn)移的患者治療

2、療效仍然不樂觀，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者的五年生存率要低于10％。因此，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)以及闡明其作用機(jī)制對于提高結(jié)直腸癌患者的生存率、改善結(jié)直腸癌的治療效果將具有非常重要的意義。
　　鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMKs）是一類具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的激酶家族，其通過鈣離子信號通路來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生存與活性。鈣離子與廣泛表達(dá)的鈣調(diào)蛋白相結(jié)合，使其發(fā)生構(gòu)象改變，促進(jìn)鈣調(diào)蛋白與不同的CaMKs結(jié)合，從而能使CaMKs

3、發(fā)生構(gòu)象改變，導(dǎo)致酶的活化。CaMKs包括CaMKⅠ，Ⅱ，Ⅳ和K，其中研究的最多的是CaMKⅡ，CaMKⅡ又包括CaMKⅡα，β，γ和δ四種亞型。研究表明CaMKⅡ與多種惡性腫瘤如白血病、骨肉瘤等的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，然而其與結(jié)直腸癌的關(guān)系尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)對CaMKⅡγ促結(jié)直腸癌增殖的作用進(jìn)行了較系統(tǒng)的體內(nèi)和體外研究，體外研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡγ可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞生長與克隆形成，荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)CaMKⅡγ有

4、促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞在體內(nèi)增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡγ促進(jìn)NFκB通路中的IKK磷酸化，IKK激活后可以磷酸化I1B從而促使IκB降解，使其與NFκB P65分離，P65進(jìn)核增加，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。總之，本研究證實(shí)，結(jié)直腸癌細(xì)胞中存在著CaMKⅡγ的高活化狀態(tài)，而CaMKⅡγ的高活化可以通過促進(jìn)NFκB信號通路的激活而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖。化學(xué)致癌劑和炎癥因子可能是通過CaMKⅡγ而促進(jìn)NFκB信號通路的激活，因此我們推斷，

5、CaMKⅡγ可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。
　　目的：
　　研究鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱγ（CaMKⅡγ）體內(nèi)外促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用，并探討其機(jī)制。
　　方法：
　　1.半定量RT-PCR法測定5種結(jié)直腸癌細(xì)胞系及20對結(jié)直腸癌組織及其配對癌旁組織中CaMKⅡγ的mRNA表達(dá)水平。
　　2.MTT法檢測CaMKⅡ的抑制劑KN93對SW480和SW620結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用3.Wester

6、n blot檢測CaMKⅡ抑制劑KN93對SW620細(xì)胞的IKKα、IKKβ、IKKγ、p-IKKα/β、p-IκB和IκB表達(dá)水平的影響。
　　4.用慢病毒載體pLenti6.3-MCS-IRES2-eGFP(Invitrogen，USA)制備慢病毒顆粒Lenti-CaMKⅡγ，轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞。
　　5.繪制細(xì)胞生長曲線觀察CaMKⅡγ對SW620細(xì)胞增殖能力的影響。平板克隆形成試驗(yàn)觀察CaMKⅡγ對SW620細(xì)胞克隆

7、形成能力的影響。
　　6.Western blot檢測CaMKⅡγ對SW620細(xì)胞的IKKα、IKKα、IKKγ、p-IKKα/β p-IκB和IκB表達(dá)水平的影響。
　　7.免疫熒光檢測穩(wěn)定表達(dá)CaMKⅡγ后SW620細(xì)胞的NFκB P65核漿及核內(nèi)的表達(dá)情況。
　　8.裸鼠移植瘤試驗(yàn)觀察穩(wěn)定表達(dá)CaMKⅡγ后SW620細(xì)胞成瘤能力的改變，及瘤體中IKKα、IKKβ、IKKγ、p-IKKα/β、p-IκB和IκB的表

8、達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.以K562作為陽性對照，RKO、HCT-116、SW620細(xì)胞系中CaMKⅡγ的mRNA水平與K562相近，而HT29細(xì)胞系中CaMKⅡγ的mRNA水平是K562的1.8倍。20對結(jié)直腸癌的癌組織與癌旁組織中，有18對的癌組織中CaMKⅡγ的mRNA水平比在癌旁組織中高(90％)，癌組織和癌旁組織中CaMKⅡγ的mRNA表達(dá)水平分別是0.67±0.475，0.26±0.305，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

9、＜0.05）。
　　2.和陰性對照組相比，10μM的KN93處理SW620細(xì)胞48h和72h后，KN93處理組細(xì)胞減少9.5％和50.2％;作用于SW480細(xì)胞48h和72h后，KN93處理組細(xì)胞減少24.3％和36.2％。20μM的KN93處理SW620細(xì)胞48h和72h后，KN93處理組細(xì)胞減少62.8％和90.1％;作用于SW480細(xì)胞48h和72h后，KN93處理組細(xì)胞減少34.9％和76.9％。
　　3.KN93及

10、其陰性對照KN92，作用SW620細(xì)胞系48h后，加PMA與TNFα刺激NFκB通路30min，與陰性對照相比，KN93處理細(xì)胞的IKKα、IKKβ、IKKγ蛋白表達(dá)無明顯變化，p-IKKα/β、p-IκB蛋白表達(dá)下降，Iκ出蛋白表達(dá)增強(qiáng)。
　　4.用慢病毒載體pLenti6.3-MCS-IRES2-eGFP(Invitrogen，USA)成功制備慢病毒顆粒Lenti-CaMKⅡγ，轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后，Western blot檢

11、測轉(zhuǎn)染細(xì)胞CaMKⅡγ蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)明顯增高。
　　5.生長曲線顯示SW620-CaMKⅡγ細(xì)胞增殖能力比SW620-EGFP細(xì)胞強(qiáng)，從第三天開始結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;平板克隆形成試驗(yàn)顯示SW620-CaMKⅡγ細(xì)胞的克隆形成率比SW620-EGFP細(xì)胞高30.4％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　6.SW620-CaMKⅡγ細(xì)胞與SW620-EGFP細(xì)胞相比，IKKα、IKKβ、IKKγ蛋白表達(dá)無

12、明顯變化，p-IKKα/β、p-Iκ3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Iκ出蛋白表達(dá)下降。
　　7.免疫熒光檢測顯示SW620-CaMKⅡγ細(xì)胞與SW620-EGFP細(xì)胞相比，NFκB P65進(jìn)核增加。
　　8.裸鼠成瘤試驗(yàn)顯示，SW620-CaMKⅡγ細(xì)胞成瘤后的瘤徑在成瘤后第8天和第12天分別為SW620-EGFP細(xì)胞的1.46倍和1.68倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。SW620-CaMKⅡγ細(xì)胞成瘤的瘤體與SW620-EGFP細(xì)胞

13、相比，IKKα、IKKβ、IKKγ蛋白表達(dá)無明顯變化，p-IKKαβ、p-IκB蛋白表達(dá)增強(qiáng)，IκB蛋白表達(dá)下降。
　　結(jié)論：
　　1.人結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織中CaMKⅡγ在mRNA水平較高。但是細(xì)胞株不同，其表達(dá)水平不同。
　　2.CaMKⅡγ可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的體外生長與克隆形成能力。
　　3.CaMKⅡγ可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。
　　4.CaMKⅡγ能夠激活結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的N