鈣及鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性激酶在神經(jīng)元缺氧性損傷中的作用及其細(xì)胞內(nèi)機(jī)理研究.pdf

1、第一部分胚鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的體外培養(yǎng)、鑒定及神經(jīng)元缺氧模型的建立與評(píng)價(jià) 目的：建立胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)體系和建立神經(jīng)元缺氧培養(yǎng)模型，并對(duì)神經(jīng)元缺氧模型進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。 方法： 1．改良目前被廣泛使用的方法，采取聯(lián)合使用0.05％胰酶及10IU／mlDNase I獲取神經(jīng)元單細(xì)胞懸液，以加入2％B27,5％胎牛血清，1％Glutamax的Neurobasal Medium作為接種及維持培養(yǎng)基，接種48小時(shí)加入阿糖胞

2、苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，綜合使用上述方法建立體外神經(jīng)元培養(yǎng)體系； 2．使用Tubulin βⅢ單克隆抗體標(biāo)記神經(jīng)元，GFAP多克隆抗體標(biāo)記星型膠質(zhì)細(xì)胞，運(yùn)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元純度：3．使 用國(guó)產(chǎn)厭氧培養(yǎng)箱充入85％N2、5％CO2、10％H2混合氣建立胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的缺氧模型；4．倒置相差顯微鏡下觀察缺氧不同時(shí)點(diǎn)胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)元缺氧模型進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。 結(jié)果： 1．聯(lián)合使用0.05％胰

3、酶及10IU／m1DNase Ⅰ消化胚鼠大腦皮質(zhì)，使用加入2％B27，5％胎牛血清，1％Glutamax的Neurobasal Medium作 為接種及維持培養(yǎng)基，接種48小時(shí)后加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，可獲取純度在95％以上的胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元； 2．培養(yǎng)的胚鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的純度>95％，星型膠質(zhì)細(xì)胞的沾染率 <5％；3．倒置相差顯微鏡觀察顯示在缺氧4小時(shí)后，神經(jīng)元胞漿內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)空泡，折光性減弱；缺氧8小時(shí)后，細(xì)胞胞體皺

4、縮，胞漿中空泡明顯，部分細(xì)胞可見(jiàn)崩解現(xiàn)象；缺氧12小時(shí)，大部分細(xì)胞輪廓模糊，胞體固縮成團(tuán)，出現(xiàn)明顯的核碎裂與核溶解；缺氧16小時(shí)，細(xì)胞崩解現(xiàn)象加??；缺氧24小時(shí)，細(xì)胞及其突起幾乎完全崩解消失。 結(jié)論： 1． 成功建立了高純度神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系； 2． 使用國(guó)產(chǎn)厭氧培養(yǎng)箱充入85％N<,2>、5％CO<,2>、10％H<,2>混合氣可成功建立胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的缺氧模型； 3．體外培養(yǎng)0—8小時(shí)是神經(jīng)元對(duì)

5、缺氧最為敏感的時(shí)間。 第二部分 鈣信號(hào)通路在缺氧性損傷中的作用 目的：探討鈣信號(hào)系統(tǒng)在缺氧性腦損傷中的作用及與BDNF抗缺氧性損傷間的關(guān)系。 方法：分別采用L-VSCC阻滯劑尼莫地平、NMDA受體阻滯劑MK-801、AMPA受體阻滯劑CNQX拮抗胞外鈣內(nèi)流，并采用CaMKⅡ阻滯劑KN-93拮抗CoMKⅡ，使用MTT法及LDH法檢測(cè)細(xì)胞活性，對(duì)比單純?nèi)毖踅M，各種鈣拮抗劑干預(yù)組，BDNF干預(yù)組及BDNF+拮抗劑干預(yù)

6、組細(xì)胞活性的差別。 結(jié)果： 1．使用尼莫地平干預(yù)組，MK-801干預(yù)組及KN-93干預(yù)組細(xì)胞活性較單純?nèi)毖踅M高，CNQX的作用不肯定，聯(lián)合使用MK-801及CNQX組細(xì)胞活性反而較單純?nèi)毖踅M低。 2．各種阻滯劑干預(yù)組與阻滯劑+BDNF組比較，細(xì)胞活性無(wú)顯著性差別，各種阻滯劑+BDNF干預(yù)組與BDNF干預(yù)組細(xì)胞活性無(wú)顯著性差異。 結(jié)論： 1．鈣信號(hào)系統(tǒng)參與了神經(jīng)元的缺氧性損傷； 2．L-VS

7、CC通道及NMDA受體可能是啟動(dòng)缺氧性神經(jīng)元損傷的主要鈣信號(hào)通道，AMPA通道不起主要作用，CaMKⅡ參與了神經(jīng)元的缺氧性損傷。 3．通過(guò)L-VSCC，NMDA受體，AMPA受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可能不是BDNF減輕神經(jīng)元缺氧損傷的主要信號(hào)通路。 第三部分 神經(jīng)元缺氧性損傷中細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的波動(dòng) 目的：探討神經(jīng)元缺氧損傷中細(xì)胞內(nèi)游離鈣的波動(dòng)。 方法：以Fluo-4AM作為鈣熒光探針，采用激光共聚焦顯微鏡掃描的

8、方式測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。 結(jié)果： 1．鈣離子濃度并非隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)成線形增長(zhǎng)，在缺氧4小時(shí)達(dá)頂峰，缺氧時(shí)間延長(zhǎng)后>6hr，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度反而降低； 2．BDNF干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度較單純?nèi)毖踅M高； 3．尼莫地平干預(yù)組及MK-801干預(yù)組出現(xiàn)了明顯的鈣振蕩； 4．尼莫地平可短期迅速降低缺氧神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)鈣，但隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)鈣仍可達(dá)到很高的水平；MK-801干預(yù)組可長(zhǎng)時(shí)間降低缺氧

9、神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)鈣，但其短期阻滯鈣內(nèi)流的效率不如尼莫地平。 5．KN-93基本不能降低缺氧神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣水平。 結(jié)論： 1．缺氧刺激可激活鈣信號(hào)系統(tǒng)，引起胞外鈣內(nèi)流； 2．激活鈣信號(hào)通路可能是BDNF抗缺氧性腦損傷的機(jī)理之一； 3．阻滯胞外鈣過(guò)度內(nèi)流，避免細(xì)胞內(nèi)鈣超載可能是尼莫地平，MK-801，CNQX對(duì)缺氧神經(jīng)元保護(hù)作用的一個(gè)重要原因； 4．KN-93對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用不是減少鈣超載。

10、 第四部分 鈣信號(hào)通路在缺氧神經(jīng)元損傷中的機(jī)理研究 目的：探討參與缺氧性腦損傷主要的鈣信號(hào)通路 方法：采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)單純?nèi)毖踅M，BDNF干預(yù)組，各種鈣通路阻滯劑干預(yù)組及BDNF+鈣通道阻滯劑干預(yù)組在pCREB、CaMKⅡ、CaMKIV、pERK及pAKT的表達(dá)方面的差異。 結(jié)果： 1．缺氧刺激可誘導(dǎo)CaMKⅡ表達(dá)的下調(diào)及CaMKⅣ表達(dá)的上調(diào)； 2．KN-93可顯著抑制CaMKⅡ的表

11、達(dá)，尼莫地平也可使CaMKⅡ的表達(dá)明顯減少，CNQX可使CaMKⅡ的表達(dá)部分減少，但胍MK-801似乎對(duì)CaMKⅡ的表達(dá)無(wú)明顯影響； 3．MK-801可明顯抑制CaMKIV的表達(dá)，其次為尼莫地平，而KN-93對(duì)CaMKⅣ表達(dá)的抑制作用不明顯： 4．缺氧可使磷酸化CREB的表達(dá)增加，而B(niǎo)DNF干預(yù)可使磷酸化CREB的表達(dá)持續(xù)增加； 5．MK-801，CNQX，KN-93及尼莫地平均可使pCREB不表達(dá)或表達(dá)明顯減少

12、； 6．尼莫地平可使磷酸化ERKl／2的表達(dá)顯著減少； 7．尼莫地平，CNQX及KN-93均明顯抑制磷酸化AKT表達(dá)： 8．使用鈣通路阻滯劑后對(duì)BDNF干預(yù)組磷酸化ERKl／2的表達(dá)無(wú)明顯影響： 9．使用各種鈣通路阻滯劑，可明顯減弱由BDNF激活的AKT表達(dá)。 結(jié)論： 1．缺氧刺激可誘導(dǎo)CaHKⅡ表達(dá)的下調(diào)及CaMKIV表達(dá)的上調(diào)； 2．經(jīng)過(guò)L-VSCC的鈣內(nèi)流可能是激活CaMKⅡ