杜梨CBL基因家族三成員序列特征、表達(dá)特點(diǎn)及功能初探.pdf

1、梨為薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomoideae)梨屬（Pyrus）植物，也是我國一種重要的果樹，梨果產(chǎn)量僅僅次于蘋果、柑橘，居第三位。杜梨本身具有較強(qiáng)的適生性，因此在我國梨樹栽培中被廣泛應(yīng)作梨砧木。目前，全世界的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境面臨的主要問題是土壤鹽漬化，土壤鹽漬化所產(chǎn)生的滲透脅迫、離子和氧化脅迫等直接威脅到梨樹的正常生長發(fā)育。類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBLs)是植物重要

2、的傳感器，在不同物種的功能和作用方式都存在差異。為了探明杜梨CBLs家族成員的序列特征、表達(dá)模式和生理功能，本論文以杜梨（Pyrus betulaefoliaBunge）幼苗為試材，分離CBLs基因并研究它們對逆境脅迫的響應(yīng)，主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)運(yùn)用EST搜索、染色體步移法、RACE技術(shù)對杜梨CBLs基因的cDNA、DNA進(jìn)行克隆，獲得了3條序列，分別命名為PbCBL2、PbCBL4和PbCBL10，比較分析基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)

3、:PbCBL2基因cDNA序列長681 bp，編碼一個含有226個氨基酸的蛋白，基因組DNA長1927 bp，包括8個外顯子和7個內(nèi)含子;PbCBL4基因的cDNA序列長639 bp，編碼一個含212個氨基酸的蛋白，基因組DNA長1645 bp，包含8個外顯子和7個內(nèi)含子;PbCBL10基因的cDNA長801 bp，編碼一個含266個氨基酸的蛋白，基因組DNA序列長1983 bp，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子。這三個基因所推導(dǎo)的多肽均包含

4、4個EF手型結(jié)構(gòu)和1個典型的植物鈣調(diào)磷酸酶A亞基結(jié)合位點(diǎn)。分別與擬南芥AtCBL2、AtCBL4和AtCBL10親緣關(guān)系最近，處在系統(tǒng)進(jìn)化樹的同一進(jìn)化枝上。
　　(2)采用半定量RT-PCR方法研究PbCBL2、PbCBL4和PbCBL10的表達(dá)特點(diǎn)，經(jīng)NaCl、PEG6000以及甘露醇脅迫處理之后，這3個基因在杜梨各器官均上調(diào)表達(dá)，但是表達(dá)規(guī)律不盡相同。施加20μmol·L-1 ABA處理后，三者在杜梨不同器官的表達(dá)規(guī)律也不相同

5、:在對照杜梨幼苗的根和葉中均沒能檢測到三者的表達(dá);PbCBL2在杜梨葉中表達(dá)先上升后下降，表達(dá)高峰出現(xiàn)在處理后16 h。PbCBL4在杜梨葉中表達(dá)量持續(xù)上升，持續(xù)到處理后24 h，在根中沒有表達(dá)。PbCBL10在杜梨幼苗葉中表達(dá)，在根中同樣沒有表達(dá)。由此發(fā)現(xiàn)杜梨PbCBL2、PbCBL4和PbCBL10的表達(dá)受ABA誘導(dǎo)上調(diào)，表明由PbCBL2、PbCBL4和PbCBL10所介導(dǎo)的鈣信號傳導(dǎo)途徑都可能為ABA依賴的調(diào)控方式。
　　

6、(3)原核表達(dá)的大腸桿菌生長實(shí)驗(yàn)中，在LB液體培養(yǎng)液中（空白對照），重組pET-22b(+)、pET-22b(+)-PbCBL2、pET-22b(+)-PbCBL4或pET-22b(+)-PbCBL10的大腸桿菌BL21(DE3)菌株之間的生長沒有表現(xiàn)出顯著性的差異;添加NaCl、PEG、甘露醇和ABA處理后，4種菌株的生長均受到抑制。伴隨著不同處理濃度的增加，菌株生長受抑制程度增加。脅迫處理對不同菌株生長的抑制程度不同。重組pET-2

7、2b(+)-PbCBL10菌株生長狀況與重組pET-22b(+)菌株（對照）相差甚小，兩者均受到顯著抑制，而重組pET-22b(+)-PbCBL2、pET-22b(+)-PbCBL4的大腸桿菌BL21(DE3)菌株則均表現(xiàn)生長減緩，表現(xiàn)出相對較強(qiáng)的抗性。通過比較發(fā)現(xiàn)PbCBL2抗性最強(qiáng)，PbCBL4次之。由此表明轉(zhuǎn)入PbCBL2、PbCBL4基因后，能夠明顯減輕NaCl、甘露醇和PEG6000對大腸桿菌BL21(DE3)的生長抑制，該菌