富硒綠茶功能成分的抗氧化和抗腫瘤作用及其機理研究.pdf

1、本文基于綠茶具有抗氧化活性和抗腫瘤功能以及植物性來源的硒具有的化學(xué)防癌作用，以綠茶作為硒載體，制備富硒綠茶，以現(xiàn)代生物活性物質(zhì)分離技術(shù)，從富硒綠茶和普通綠茶中提取、分離和制備綠茶功能成分茶多酚、茶多糖、茶蛋白，研究富硒綠茶中茶多酚、茶多糖、茶蛋白、水提物以及普通綠茶中茶多酚、茶多糖、茶蛋白、水提物及其與無機硒化合物的混合物的抗氧化活性，篩選出具有高抗氧化活性的組分或組合。采用生物學(xué)前沿技術(shù)和手段，建立人肝癌HepG2腫瘤細胞培養(yǎng)模型，研

2、究高活性成分的體外抗腫瘤作用及其機理。主要研究結(jié)果如下： 1．富硒綠茶理化指標分析表明，硒能顯著提高綠茶的感官品質(zhì)，湯色增加，苦澀味下降；游離氨基酸和蛋白質(zhì)含量顯著提高，茶多酚和葉綠素含量則沒有顯著差異。按照不同組分的提取工藝，獲得的富硒綠茶粗茶多酚中茶多酚含量為841.1±6.8 g kg<'-1>，富硒綠茶粗茶多糖中茶多糖含量為403.0±14.2 g kg<'-1>，富硒綠茶粗茶蛋白中蛋白質(zhì)含量為624.9±26.7 g

3、kg<'-1>。除蛋白質(zhì)以外，各種成分與相對應(yīng)的普通綠茶成分無顯著性差異(P>0.05)。 2．采用AAPH和DPPH兩種抗氧化體系研究富硒綠茶和普通綠茶不同組分及水提物的抗氧化活性。結(jié)果表明，富硒綠茶功能成分和水提物的抗氧化活性高于普通綠茶。AAPH法結(jié)果顯示，富硒綠茶和普通綠茶不同組分抗脂質(zhì)過氧化能力由高到低的順序為：粗茶蛋白>粗茶多酚>粗茶多糖。DPPH法結(jié)果顯示，富硒綠茶和普通綠茶不同組分清除自由基能力的順序為：粗茶多酚

4、>粗茶蛋白>粗茶多糖。測定富硒綠茶水提物及不同組分EC<,50>值，水提物為22.43±0.13μgmL<'-1>，粗茶多酚為4.03±0.01μg mL<'-1>，粗茶多糖為273.33±8.66μg mL<'-1>，粗荼蛋白為38.36±2.94μg mL<'-1>，陽性對照a-生育酚為16.65±5.34μg mL<'-1>。富硒綠茶粗茶多酚和粗茶多糖清除自由基能力顯著高于普通綠茶粗茶多酚和粗茶多糖，而粗茶蛋白之間沒有顯著性差異。

5、 3．采用硅膠柱層析法，純化得到富硒綠茶中茶多酚，其主要兒茶素單體EGCG含量為50.93％，硒含量為0.29±0.012 mg kg<'-1>，顯著高于普通綠茶中茶多酚EGCG含量46.90％，硒含量0.052±0.018 mg kg<'-1>。富硒綠茶水提物中EGCG含量為12.39％，硒含量為4.030±0.005 mg kg<'-1>，顯著高于普通綠茶水提物EGCG含量11.65％，硒含量0.037±0.002 mg k

6、g<'-1>。富硒綠茶中茶多酚及水提物的抗氧化活性顯著高于普通綠茶中荼多酚及水提物以及普通綠茶中茶多酚及水提物與亞硒酸鈉之間簡單的加合。 4．抗腫瘤作用結(jié)果表明，富硒綠茶中茶多酚及水提物、普通綠茶中茶多酚及水提物、普通綠茶中茶多酚及水提物加亞硒酸鈉等不同組合對人肺癌細胞A549(50μgmL<'-1>-200μg mL<'-1>)和人肝癌細胞HepG2(200μgmL<'-1>-1000μg mL<'-1>)均有明顯的生長抑制作

7、用，并呈劑量．效應(yīng)關(guān)系。富硒綠茶中茶多酚及水提物抑制作用顯著高于普通綠茶中茶多酚及水提物與亞硒酸鈉的組合。富硒綠茶中茶多酚及水提物對人肝癌細胞HepG2的IC<,50>分別為109.16±0.17μg mL<'-1>和217.88±0.26μg mL<'-1>，富硒綠茶中茶多酚的抑制作用強于富硒綠茶水提物。 5．可見和熒光染色結(jié)果表明，富硒綠茶中茶多酚作用于人肝癌HepG2細胞后，細胞變小，胞膜皺縮，細胞核固縮，致密濃染并伴有核

8、型的不規(guī)則變化，出現(xiàn)核碎裂等凋亡的典型特征，表明富硒綠茶中茶多酚可明顯誘導(dǎo)人肝癌細胞HepG2細胞凋亡。相同劑量下，富硒綠茶中茶多酚對人肝癌細胞HepG2的損傷作用強于富硒綠茶水提物。 6．流式細胞術(shù)檢測富硒綠茶中茶多酚對人肝癌HepG2細胞周期的影響，結(jié)果表明，250μg mL<'-1>的富硒綠茶中茶多酚處理人肝癌細胞HepG2 24 h后，早期凋亡及晚期凋亡的細胞分別占總檢測數(shù)的14％及1.6％，明顯高于未給藥對照組1.8％

9、和0.2％，相同濃度的富硒綠茶中茶多酚可使人肝癌細胞HepG2的細胞周期阻滯在S期(對照組為24.59％，給藥組為52.49％)，阻斷細胞周期向G2-M期進行，阻止細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。 Western blots免疫印跡法檢測富硒綠茶對人肝癌細胞HepG2的Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，結(jié)果表明，在500 μg mL<'-1>劑量下，富硒綠茶中茶多酚可下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達并促進凋亡誘導(dǎo)基因：Bax的表達，Ba