通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞移植治療糖尿病足的實驗研究.pdf

1、目的:本研究以脈絡(luò)學(xué)說為指導(dǎo)，通過高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)并結(jié)扎剪斷股動、靜脈建立糖尿病足大鼠模型，觀察通心絡(luò)(TXL)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞(Peripheral blood derived mesenchymal stem cells，PB-MSCs)治療后大鼠的血糖、血脂、下肢血管血流影像變化;通過觀察炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、晚期糖基化終末產(chǎn)物的變化及血管新生相關(guān)因子的表達，探討TXL聯(lián)合PB-MSCs移植治療糖尿病足促血

2、管新生的可能作用機制。通過上述研究以期為糖尿病足的治療提供新的治療方法。
　　方法:
　　1.脈絡(luò)學(xué)說指導(dǎo)糖尿病足理論探討。
　　2.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞移植治療糖尿病足大鼠的作用研究。
　　3.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞移植對糖尿病足大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及晚期糖基化終末產(chǎn)物的影響。
　　4.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞移植治療糖尿病足大鼠促血管新生的機制研究。
　　結(jié)果:
　　1.

3、通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞移植治療糖尿病足大鼠的作用研究
　　1.1.各組大鼠血糖、血脂、FINS、HOMA-IR及Ln(ISI)的變化。
　　1.2.各組大鼠不同時間點血流差值比的變化。
　　1.3.各組大鼠下肢動脈造影變化
　　正常組大鼠下肢動脈造影血流通暢，血管顯示清晰，末端小動脈顯影清晰。與對照組比較，模型組大鼠動脈造影血流緩慢，有少量側(cè)支循環(huán)形成，并相互連接成毛細血管網(wǎng)，但末端小動脈顯影減弱。與模型組

4、比較，各用藥組大鼠動脈造影顯示血流及末端小動脈顯影均有不同程度改善，有側(cè)支循環(huán)形成及毛細血管網(wǎng)形成，其中T-MSCs造影血流通暢，末端小動脈顯影最清晰。
　　2.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞移植治療對糖尿病足大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和晚期糖基化終末產(chǎn)物的影響
　　2.1.HE染色普通光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠缺血下肢肌組織病理變化
　　對照組肌纖維排列稍有紊亂，偶可見肌間質(zhì)纖維化，少量炎細胞浸潤。模型組肌纖維排列紊亂明顯，肌

5、間質(zhì)部分纖維化，炎細胞浸潤明顯。各用藥組肌纖維排列、肌間質(zhì)纖維化及炎細胞浸潤較模型組減輕，其中TXL和T-MSCs減輕較明顯。
　　2.2.透射電鏡觀察各組大鼠缺血下肢肌組織超微結(jié)構(gòu)
　　對照組:肌節(jié)、肌絲排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，少部分線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)模糊不清，肌漿網(wǎng)輕度擴張，肌膜完整。模型組:部分肌絲融合、模糊、增寬，肌原纖維稀疏、間隙增寬、有斷裂，部分線粒體水腫，嵴結(jié)構(gòu)斷裂、溶解，空泡變性，可見髓體樣化改變，外膜局部溶解、消

6、失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有擴張，肌細胞核間隙增寬。各用藥組:上述肌組織超微結(jié)構(gòu)均不同程度減輕，以TXL和T-MSCs結(jié)構(gòu)病變減輕較為明顯。
　　2.3.各組大鼠血清IL-1、IL-6及TNF-α水平比較
　　與對照組比較，模型組血清IL-1、IL-6和TNF-α水平均顯著增加(P＜0.01)。與模型組比較，PB-MSCs血清IL-1、IL-6和TNF-α水平有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;余用藥組血清IL-1、IL-6和TN

7、F-α水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。
　　2.4.各組大鼠血清SOD和MDA水平比較
　　與對照組比較，模型組血清SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組血清SOD水平均明顯升高、MDA水平均明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。
　　2.5.各組大鼠血清AGEs水平比較
　　與對照組比較，模型組血清AGEs水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，PB-

8、MSCs血清AGEs水平有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，余用藥組血清AGEs水平均明顯降低(P＜0.05)。
　　2.6.各組大鼠缺血下肢肌組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達比較
　　與對照組比較，模型組肌組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，PB-MSCs肌組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，余用藥組肌組織中IC

9、AM-1和VCAM-1蛋白表達降低(P＜0.05，P＜0.01)，其中T-MSCs肌組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平最低。
　　3.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞移植治療糖尿病足大鼠促血管新生的機制研究
　　3.1.透射電鏡觀察糖尿病足大鼠缺血下肢肌肉微血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)
　　對照組:內(nèi)皮細胞完整，結(jié)構(gòu)清晰，少部分細胞外基質(zhì)膜模糊。模型組:內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)基本完整，細胞內(nèi)線粒體少部分膜模糊不清，細胞間隙稍擴張，細胞

10、外基質(zhì)松散、不連續(xù)，部分區(qū)域溶解。各用藥組:與模型組比較，TXL和Cilostazol內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)不同程度減輕;PB-MSCs內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)不完整，大部分細胞外基質(zhì)縮窄、閉合、溶解、消失，管腔極度狹窄;T-MSCs和C-MSCs可見新生血管內(nèi)皮細胞。
　　3.2.各組大鼠缺血下肢肌組織CD34和CD105蛋白表達比較
　　與對照組比較，模型組肌組織中CD34和CD105蛋白表達顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥

11、組肌組織中CD34和CD105蛋白表達均顯著升高(P＜0.01)。其中T-MSCs肌組織中CD34和CD105蛋白表達最高。
　　3.3.各組大鼠血清VEGF-A和HIF-1α水平比較
　　與對照組比較，模型組血清VEGF-A和HIF-1α水平顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組血清VEGF-A水平均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，T-MSCs和C-MSCs血清中HIF-1α水平顯著升高(P＜0.01)。

12、與PB-MSCs比較，T-MSCs和C-MSCs血清中HIF-1α水平明顯升高(P＜0.05)。
　　3.4.各組大鼠缺血下肢肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達比較
　　與對照組比較，模型組肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達均顯著升高(P＜0.01)。各用藥組組間比較，PB-MSCs肌組織中VEGF-A和VEGF-

13、R2蛋白表達均高于Cilostazol(P＜0.05); T-MSCs和C-MSCs肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達均高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P＜0.01)。
　　3.5.各組大鼠缺血下肢肌組織中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表達比較
　　與對照組比較，模型組肌組織中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表達顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組肌組織中VEGF-A

14、和cyclinD1mRNA表達均明顯升高(P＜0.01)。各用藥組組間比較，PB-MSCs肌組織中VEGF-A和cyclinD1mRNA表達高于TXL和Cilostazol(P＜0.05);T-MSCs和C-MSCs肌組織中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表達高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P＜0.01)。
　　3.6.各組大鼠缺血下肢肌組織中cyclinD1、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達比較

15、r>　　與對照組比較，模型組肌組織中cyclinD1和p-Akt蛋白表達顯著降低，p-GSK-3β蛋白表達顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組cyclinD1和p-Akt蛋白表達均顯著升高，p-GSK-3β蛋白表達均顯著降低(P＜0.01)。各用藥組組間比較，PB-MSCs肌組織中cyclinD1和p-Akt蛋白表達高于TXL和Cilostazol(P＜0.01，P＜0.05);T-MSCs和C-MSCs肌組織中cyclin

16、D1和p-Akt蛋白表達高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs，p-GSK-3β蛋白表達低于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P＜0.05，P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究以脈絡(luò)學(xué)說為指導(dǎo)，從“脈絡(luò)-血管”保護切入，提出通絡(luò)干預(yù)防治糖尿病足作用可通過改善干細胞移植的缺血區(qū)局部微環(huán)境、促進治療性血管新生及側(cè)支循環(huán)建立，有效治療糖尿病足。
　　2.在增加糖尿病足大鼠缺血下肢血流灌注量、側(cè)支

17、循環(huán)建立方面，通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞移植治療優(yōu)于單純干細胞組，同時可以改善糖尿病足大鼠體重，降低HOMA-IR、增高Ln(ISI)，降低脂質(zhì)代謝紊亂。
　　3.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細胞可減輕炎癥水平，提高抗氧化能力，減少晚期糖基化終末產(chǎn)物堆積，減輕肌組織損傷病理及超微結(jié)構(gòu)變化，其抗炎能力優(yōu)于單純干細胞組，提示通心絡(luò)可能通過減輕炎癥反應(yīng)和氧化損傷，進而改善干細胞移植后的微環(huán)境，提高外周血間充質(zhì)干細胞局部肌肉移植后血管新生。