ZNT7在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)以及鋅缺乏影響海馬學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制.pdf

1、鋅是機(jī)體必需的微量元素，廣泛存在與神經(jīng)系統(tǒng)中參與許多生物學(xué)功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大約85％的鋅離子與蛋白質(zhì)等大分子結(jié)合或作為許多酶的輔酶，少部分游離鋅離子存在于鋅能神經(jīng)元(zinc—enriched neurons，ZEN)的突觸小泡內(nèi)。采用鋅熒光染色技術(shù)如zinquin和TSQ熒光染色技術(shù)或組織化學(xué)技術(shù)如Timm染色或金屬自顯影技術(shù)(autometallography，AMG)能夠?qū)\離子準(zhǔn)確定位。 鋅離子不能自由通過(guò)細(xì)胞膜，特

2、定的轉(zhuǎn)運(yùn)體和膜通道參與鋅離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(zinc transporter，ZNT)是參與腦鋅代謝的重要蛋白家族之一，目前已知該家族擁有8個(gè)成員，即ZNT1—8。ZNT為一組結(jié)構(gòu)和功能相近的蛋白質(zhì)，均具有六個(gè)跨膜區(qū)域并且有一個(gè)區(qū)域含有豐富的組氨酸，為鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)，ZNT的主要功能是將鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞或聚集在細(xì)胞器內(nèi)，其中ZNT7是一個(gè)分子量為42 kDa的膜蛋白，定位于高爾基復(fù)合體內(nèi)，參與鋅離子在高爾基復(fù)合體內(nèi)的聚集和

3、含鋅蛋白質(zhì)的加工和組裝，是維持神經(jīng)系統(tǒng)鋅穩(wěn)態(tài)的重要ZNT之一。研究表明ZNT7存在于神經(jīng)系統(tǒng)的大腦和脊髓等，本研究則進(jìn)一步對(duì)ZNT7在小腦和交感神經(jīng)節(jié)的分布和表達(dá)進(jìn)行了詳細(xì)地研究。 海馬是產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程記憶和短時(shí)程記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，是記憶編碼、整理和檢索的樞紐。在海馬齒狀回和CA3區(qū)大量的游離鋅離子存在于苔蘚纖維的突觸小泡內(nèi)。在突觸興奮過(guò)程中，鋅離子釋放到突觸間隙內(nèi)，作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)調(diào)節(jié)突觸后膜受體的功能；同時(shí)鋅離子還能進(jìn)入突觸后神經(jīng)元，

4、參與海馬學(xué)習(xí)記憶通路的調(diào)節(jié)。研究表明鋅缺乏能夠減少海馬鋅離子聚集，并引起學(xué)習(xí)記憶功能的損傷，但到目前為止鋅缺乏影響海馬學(xué)習(xí)記憶的具體機(jī)制還不十分清楚。海馬神經(jīng)元死亡和再生與突觸可塑性的形成密切相關(guān)，成年哺乳動(dòng)物海馬齒狀回是神經(jīng)干細(xì)胞的重要區(qū)域之一，齒狀回顆粒細(xì)胞下層的神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元，新生的神經(jīng)元移行入顆粒細(xì)胞層并發(fā)出苔蘚纖維參與海馬的突觸環(huán)路的形成，但鋅缺乏是否通過(guò)影響神經(jīng)干細(xì)胞分化以及促進(jìn)神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能損傷還不

5、十分清楚。此外，海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-Term potentiation，LTP)與大腦的學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，大量文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞內(nèi)CaM—CaMKⅡ—CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與LTP的形成，令人感興趣的是，目前已經(jīng)證實(shí)在苔蘚纖維—CA3的突觸通路中，鋅能神經(jīng)元軸突終末釋放的內(nèi)源性鋅離子是誘導(dǎo)LTP形成的重要因素，鋅缺乏是否通過(guò)影響CaM—CaMKⅡ—CREB通路蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶功能尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子

6、生物學(xué)技術(shù)，對(duì)鋅離子和ZNT7在CD—1小鼠神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的定位分布和表達(dá)、鋅缺乏對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化以及CaM—CaMKⅡ—CREB通路蛋白的影響進(jìn)行系統(tǒng)分析，為深入探討鋅缺乏導(dǎo)致腦鋅代謝紊亂及其影響海馬神經(jīng)元學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 選取3周齡CD—1雄性小鼠飼以低鋅飼料(鋅：0.85mg/kg，AIN—76A，美國(guó)Research Diets)，建立鋅缺乏動(dòng)物模型，同周齡小鼠飼以適鋅飼料作為對(duì)照組

7、。 應(yīng)用金屬自顯影AMG技術(shù)檢測(cè)CD—1小鼠神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)游離鋅離子的分布；應(yīng)用免疫組織化學(xué)、免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦掃描顯微技術(shù)檢測(cè)ZNT7在CD—1小鼠神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的定位分布及其與鋅離子的關(guān)系；應(yīng)用AMG和TSQ熒光染色技術(shù)檢測(cè)鋅缺乏CD—1小鼠海馬游離鋅離子的表達(dá)變化；應(yīng)用免疫組織化學(xué)、免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦掃描顯微技術(shù)分析鋅缺乏小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化；應(yīng)用Western blot技術(shù)及TUNEL染色對(duì)鋅缺乏影響神經(jīng)細(xì)

8、胞死亡的機(jī)制進(jìn)行分析；應(yīng)用Western blot技術(shù)分析鋅缺乏CD—1小鼠海馬學(xué)習(xí)記憶通路蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)論： 1、CD—1小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中富含ZNT7蛋白，ZNT7參與鋅離子在高爾基復(fù)合體內(nèi)的聚集。 2、鋅缺乏導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩并降低發(fā)育期小鼠海馬內(nèi)鋅含量。 3、鋅缺乏降低海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化能力并促進(jìn)神經(jīng)元死亡，可能是鋅缺乏影響學(xué)習(xí)記憶能力的原因之一。 4、鋅缺乏抑制海馬CaM—CaMK