天南星和王不留行中分離優(yōu)選抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、原肌球蛋白相關(guān)酪氨酸激酶(TrkA)受體在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌細(xì)胞等一些細(xì)胞高表達(dá)，這些受體可以作為重要的癌癥生物標(biāo)志物。癌癥生物標(biāo)記為癌癥風(fēng)險(xiǎn)評估，疾病的診斷、預(yù)防和監(jiān)測提供工具，在研究中用于藥物靶向治療或潛在作用點(diǎn)。本研究采用富含TrkA受體的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為潛在藥物的靶點(diǎn)。通過U251細(xì)胞和活化硅球連接后形成富含TrkA受體的脂筏生物材料，并應(yīng)用于抗腫瘤成分的在線篩選。尋找有效的抗腫瘤藥物一直是全世界關(guān)注的熱

2、點(diǎn)。毋庸置疑，新的研究方向正轉(zhuǎn)向?yàn)樾滦涂鼓[瘤先導(dǎo)化合物的鑒定，這對補(bǔ)充完善現(xiàn)有的抗腫瘤藥物具有重要的作用。目前，臨床所用60％的抗癌藥物是從來源極其豐富的植物和天然產(chǎn)物中分離得到的。藥用植物，由于具有極其多樣的生化作用，成為大多數(shù)新型抗癌藥化療藥物的主要來源。因此，新興潛力植物的開發(fā)和生物醫(yī)藥新技術(shù)的應(yīng)用有利于完善現(xiàn)有的研究領(lǐng)域。然而，天然產(chǎn)物成分復(fù)雜多樣，治療機(jī)制不明確，生物篩選系統(tǒng)有限，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)缺乏以及靶向特異性差等，這些因素都

3、嚴(yán)重制約了從藥用植物中獲得的某些活性成分在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展。為了攻克這一難題，尋找涵蓋多學(xué)科、技術(shù)和循證研究的先進(jìn)理念的整體分析方法就十分必要。隨著藥物開發(fā)模式從單一靶點(diǎn)到多靶點(diǎn)的發(fā)展，中草藥成為發(fā)掘多靶點(diǎn)的抗腫瘤化合物的研究熱點(diǎn)。本研究構(gòu)建的篩選系統(tǒng)在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上進(jìn)行了長足改進(jìn)，以便于篩選出更多具有多靶點(diǎn)抗腫瘤活性的天然組分。因此，本文旨在利用脂筏親和色譜從兩種具有抗腫瘤活性的中草藥（天南星和王不留行）中尋找并鑒定抗腫瘤化合物

4、。所選的兩種中草藥具有悠久的民族藥用歷史和廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)血糖等，且二者在中國均具有廣泛的分布范圍。天南星的塊莖通常用于鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和殺蟲劑等方面，而其種子可用來活血化瘀、治療閉經(jīng)、促進(jìn)乳汁分泌、愈合傷口以及治療癌癥等。植物化學(xué)研究表明天南星中富含生物堿、皂苷和萜類化合物。現(xiàn)有的研究表明王不留行的主要成分為黃酮苷類、環(huán)肽、三萜皂苷、類脂、脂肪酸和單糖等物質(zhì)。本文研究的重點(diǎn)是利用脂筏生物定向篩選的方法從這兩種中草

5、藥（天南星和王不留行）中分離和鑒定具有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物，優(yōu)化篩選條件，并進(jìn)一步研究其抗腫瘤的作用機(jī)制。全文主要分為以下五部分:
　　1.天然產(chǎn)物可作為新的抗腫瘤先導(dǎo)化合物的有效來源
　　本部分內(nèi)容對來源于天然產(chǎn)物的新型活性抗癌化合物，尤其是中國的中草藥，成功用于癌癥治療的案例進(jìn)行了簡單的綜述;對分離和鑒定這些化合物的方法進(jìn)行了重點(diǎn)闡述;對抗腫瘤藥物的現(xiàn)代篩選技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)。此外，對天然產(chǎn)物的有效部位，尤其是提取物及其制

6、劑，進(jìn)行積極的探索，并對多靶點(diǎn)抗腫瘤活性進(jìn)行有力的陳述。本文利用脂筏硅膠固定相從用藥價(jià)值、化學(xué)成分豐富和藥理作用突出的兩種中草藥（王不留行和天南星）中篩選抗腫瘤活性成分為例說明進(jìn)行闡述，為本文隨后開展的研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　2.脂筏生物定向篩選潛在抗腫瘤活性的藥草
　　本文選擇了10種當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)用于治療癌癥的中草藥，利用脂筏親和色譜進(jìn)行快速篩選。主要內(nèi)容包括:包含首先從膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株中提取出的富含TrkA受體，并將

7、其固定在活化的脂筏硅膠球表面;隨后將該脂筏硅膠球固定裝填于色譜柱性形成脂筏硅膠固定相(LRSB)，并在線篩選不同中草藥的抗腫瘤活性成分。本研究選用的兩種潛在抗腫瘤活性中草藥（天南星和王不留行）的乙醇提取部位在親和色譜圖上均有不同的保留行為。然后，采用脂筏親和色譜對不同的活性部位（石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和萃余提取液）進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選，確定正丁醇有效部位具有抗腫瘤活性。通過MTT法檢測兩種中草藥的正丁醇活性部位對

8、肝癌細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)均具有抗腫瘤活性。脂筏生物分析得到的數(shù)據(jù)與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。因此，確定兩種中草藥的正丁醇有效部位具有抗腫瘤活性，為后續(xù)抗腫瘤藥物的分離、鑒定及其作用機(jī)制研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　3.分離和鑒定具有抗腫瘤活性的化合物
　　在本章節(jié)中，從天南星和王不留行中分離并充分鑒定得到了有抗腫瘤活性的化合物。采用多級提取、分離和純化三水平的生物導(dǎo)向分離方法得到了活性化合物，采用核磁共振氫譜、碳譜、質(zhì)譜以及文獻(xiàn)信息對

9、其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。其中鑒定得到具有顯著抗腫瘤作用的化合物包括:從王不留行中分離得到的王不留行次皂甙E(vaccarosideE)、三萜皂甙類成分（segetoside H和segetoside I）以及分子量為726、840、1071、1265、1390和1576的未知的化合物。通常，文獻(xiàn)報(bào)道王不留行種子中分離得到的雙糖鏈皂苷一直是抗腫瘤作用最顯著的成分;然而，本研究發(fā)現(xiàn)一些環(huán)肽也具有類似的活性?；钚宰顝?qiáng)的化合物（segetoside

10、I，NC913，NC1482和NC1776）顯示了廣譜抗腫瘤作用，對多種人癌細(xì)胞細(xì)胞系（肝癌HepG2;神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251;胃癌BGC，HGC&SGC;結(jié)腸癌Lovo-1）均顯示出顯著的毒性作用。這些化合物的抗腫瘤作用，尤其是雙糖鏈皂苷，與其結(jié)構(gòu)上的糖配基和不同的糖單位密切相關(guān)。天南星的有效成分也對HepG2顯示出顯著的毒性作用，其效果與5-氟尿嘧啶相當(dāng)。對于天南星的提取物還需要進(jìn)一步純化分離，進(jìn)一步發(fā)掘可能有效的抗腫瘤化合物。

11、　　4.以得率為指標(biāo)優(yōu)選分離抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物的提取工藝
　　本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示從王不留行中分離得到的雙糖鏈皂苷(CBS)是藥用植物中最有效的抗腫瘤活性的化合物。由于活性抗腫瘤化合物分離的得率很小，這就大大限制了臨床前研究和臨床實(shí)驗(yàn)地廣泛開展，所以，建立有效的提取模型以提高有效抗腫瘤化合物的得率為有效抗癌藥物的開發(fā)鋪平了道路。據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)中與浸泡提取、超聲輔助提取和熱重通量提取方式相比較，微波輔助提取(MAE)的

12、提取方法最佳。不同的提取方法對分離的化合物的質(zhì)量沒有顯著影響。MAE最佳實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件為:50％乙醇、40 mL/g（液/固比）、25 min、140 W微波功率，提取得率為0.765％;而最經(jīng)濟(jì)實(shí)用的反應(yīng)條件為:40％乙醇、30 mL/g（液/固比）、10 min、100W微波功率，提取得率為0.729％。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CBS中包含的主要成分vaccaroside E-1422、segetoside H-1448和segetos

13、ide I-1464對HepG2肝癌細(xì)胞和SCG胃癌細(xì)胞顯示出顯著的體外細(xì)胞抗腫瘤活性，且作用明顯優(yōu)于臨床抗癌藥物5-氟尿嘧啶。結(jié)果表明MAE為分離提取CBS最有效的技術(shù)，且雙糖鏈皂苷與王不留行抗癌作用相關(guān)。
　　5.源自王不留行的植物雙糖鏈皂苷Segetoside I作用機(jī)制的基礎(chǔ)研究
　　本實(shí)驗(yàn)旨在說明segetoside I對不同人癌細(xì)胞系（肝癌，HepG2;神經(jīng)膠質(zhì)瘤:U251;胃癌:BGC、HGC、SGC;結(jié)腸癌:

14、lovo-1）的抑制效果和可能的作用機(jī)制。因此，以不同濃度的segetoside I分別作用于癌細(xì)胞，通過MTT法測定細(xì)胞存活率。采用Hoechst和AnnexinⅤ/PI雙染、流式細(xì)胞技術(shù)分別研究scgetoside I對腫瘤細(xì)胞的體外誘導(dǎo)凋亡機(jī)制。構(gòu)建了HepG2細(xì)胞株裸鼠移植瘤模型，對segetoside I的體內(nèi)抑瘤活性進(jìn)行了評價(jià)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明segetoside I對HepG2細(xì)胞株的效果優(yōu)于其他細(xì)胞，且對小鼠胚胎成纖維