低乙醇脫氫酶Ⅱ活性的抗老化啤酒酵母工程菌的構(gòu)建.pdf

1、乙醛是啤酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)之一，低濃度的乙醛使啤酒具有芳香味，高濃度則產(chǎn)生像青草或者蘋果腐爛的味道。以國內(nèi)啤酒為例，乙醛含量多在5-12mg/L，而國外優(yōu)質(zhì)啤酒的乙醛含量多在3mg/L以下。目前，國內(nèi)啤酒生產(chǎn)中控制乙醛含量采用的方法主要是生產(chǎn)工藝改良，但實(shí)際效果并不明顯。乙醛含量已經(jīng)成為國內(nèi)啤酒風(fēng)味改良的瓶頸，一直難有突破。隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，在基因水平上對釀酒酵母進(jìn)行修飾，最終實(shí)現(xiàn)降低乙醛含量的目的已經(jīng)成為可能。本文利用自克隆技術(shù)

2、，構(gòu)建了一株新型啤酒酵母工程菌，并對其進(jìn)行了小型發(fā)酵試驗(yàn)，檢測了重要的產(chǎn)物含量和發(fā)酵指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容和結(jié)果見下： 根據(jù)文獻(xiàn)報道的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)乙醇脫氫酶Ⅱ(ADH2)基因序列設(shè)計(jì)引物，以YSF31的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得ADH2基因及其上游700bp序列的一段DNA片段，將該片段插入到質(zhì)粒YEp352上，構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒pYA。將篩選標(biāo)記基因CUP1和γ-谷氨酰半胱氨酸

3、合成酶基因GSH1插入到質(zhì)粒pYA的ADH2基因中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pACG。用PvuⅡ酶切重組質(zhì)粒pACG得到一個DNA片段：含有銅抗性基因CUP1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1，兩端含有ADH2基因的5’端和3’端序列。用此DNA片段轉(zhuǎn)化啤酒酵母YSF31，使該片段與染色體在ADH2位點(diǎn)發(fā)生同源重組。通過細(xì)胞對硫酸銅的抗性篩選到轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗(yàn)證，片段成功重組到受體菌的染色體上。由于遺傳操作引入的基因片段都是來源子酵母自身，

4、故該工程菌被稱為自克隆菌株。 對受體菌和自克隆菌株的銅抗性進(jìn)行測定，結(jié)果顯示受體菌和自克隆菌株在含有5mmol/LCuSO4YEPD培養(yǎng)基上都能生長，受體菌在含有6mmol/LCuSO4的YEPD培養(yǎng)基上就不能生長。而自克隆菌株在含有6mmol/L，7mmol/L，8mmol/LCuSO4的YEPD培養(yǎng)基上均能生長。經(jīng)檢測，自克隆菌株的銅抗性達(dá)到8.5mmol/L的Cu2+濃度。對受體菌和自克隆菌株的GSH含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示

5、，在酵母胞內(nèi)自克隆菌株的GSH含量比受體菌高15％；在發(fā)酵液中自克隆菌株的GSH含量比受體菌高42％。銅抗性和GSH含量測定的結(jié)果說明，CUP1基因和GSH1基因被重組到受體菌的染色體上，并成功共表達(dá)。 對受體菌和自克隆菌株進(jìn)行的小型發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵液中的谷胱甘肽含量，自克隆菌株比受體菌YSF31高34％。而ADH2基因的破壞，使ADHⅡ酶活性明顯降低，自克隆菌株的酶活是受體菌的65％。自克隆菌株的其它發(fā)酵指標(biāo)如α-N氨基