Bt水稻及其外源基因表達蛋白的環(huán)境行為與生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、國內(nèi)外在轉(zhuǎn)Bt基因作物的培育上，已經(jīng)取得了較大進展。我國在轉(zhuǎn)Bt基因水稻的轉(zhuǎn)育方面居世界先進水平，且很有可能成為世界上率先商品化種植轉(zhuǎn)基因水稻的國家之一。因此，有關(guān)Bt水稻的環(huán)境安全性研究顯得尤為迫切和重要。BtZK稻中外源基因及其表達產(chǎn)物可能是一類潛在的環(huán)境外源污染物，有關(guān)這類生物大分子在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的環(huán)境行為等方面的研究已成為國內(nèi)外新的研究熱點，具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實意義。然而，由于Bt作物中表達的Bt蛋白豐度較低，要從中獲得足夠量

2、的Bt純蛋白有一定的難度，致使目前研究多采用植物組織或源于微生物表達的Bt蛋白，難以全面反映Bt作物表達的Bt蛋白的實際環(huán)境行為。此外，外源基因的插入打亂了原有的基因網(wǎng)絡(luò)，可能引起轉(zhuǎn)基因作物的生理生化過程或代謝途徑的改變從而產(chǎn)生多效性，轉(zhuǎn)基因作物對逆境(重金屬脅迫)的應(yīng)答能力是否會因此而改變，國內(nèi)外迄今報道甚少?？嗣?KMD)是含有Bt基因(crylab)和選擇標記基因(htp與nptⅡ)且高抗8種鱗翅目害蟲的轉(zhuǎn)Bt基因水稻。有關(guān)克螟

3、稻及其外源基因表達蛋白(CrVlAb、HPT和NPTⅡ蛋白)的環(huán)境行為與生物學(xué)效應(yīng)的研究迄今鮮見報道。 本研究以克螟稻及其親本(秀水11)為試材，在建立CrylAb蛋白純化制備方法、土壤中crylAb蛋白的提取方法以及HPT蛋白酶聯(lián)免疫分析方法的基礎(chǔ)上，通過實驗室和田間試驗，研究了(1)KMD中CrylAb蛋白的時空表達、根系分泌及根際殘留；(2)CrylAb純蛋白在膨潤土、高嶺石、腐殖酸及土壤中的吸附行為；(3)CrylAb蛋

4、白在土壤中的好氣和淹水降解動態(tài)；(4)KMD中HPT和NPTⅡ蛋白的時空表達、根系分泌及根際殘留特性；(5)重金屬脅迫條件下KMD對多種元素的吸收和積累。主要結(jié)果如下： 1.CrylAb蛋白純化制備和土壤中該蛋白提取方法的建立 采用0.1mol·L-1 Na2CO3-NaHCO3+5mmol·L-1DTT緩沖液作為提取劑，從Bt水稻秸稈中提取CrylAb蛋白。提取液經(jīng)過冷凍干燥濃縮、截留分子量濃縮至較小體積，然后用(NH

5、<,4>)<,2>SO<,4>分級沉淀(20％去雜蛋白，80％收集CrylAb蛋白)、離子交換色譜(A-50)、凝膠滲透色譜(G-150)等步驟后，得到了純度較高的CrylAb蛋白(經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測相對純度80％以上)。生物活性測定表明，所得的CrylAb純蛋白保留殺蟲活性。 從土壤中高效提取蛋白具有較高的難度。國內(nèi)外現(xiàn)有的方法提取某些土壤中的CrylAb蛋白效率普遍較低(提取效率4.6～35％)。為了研究該蛋白在土壤

6、環(huán)境中的行為與歸趨，建立適宜的提取方法是尤為重要的。本研究通過CrylAb蛋白和Bt水稻秸稈添加試驗，以0.1mol·L-1 NA2-CO3-NaHCO3(ph10.0)+5.0mmol·L-1 EDTA+50mmol·L-1 Na4P2O7·10H2O+0.1％Triton X-100為提取緩沖液，并結(jié)合CrylAb-ELISA方法，從不同土壤中高效提取CrylAb蛋白-的效率分別46.18～81.73％和47.72～82.25％。

7、 2．HPT蛋白檢測ELISA方法的建立 利用一種簡便并且高效的微生物表達體系，將hpt基因的全編碼序列克隆到原核表達質(zhì)粒pGEX-KG上，在E Coli菌株BL21(DE3)-pLys中進行誘導(dǎo)表達，獲得了融合蛋白GST-HPT，經(jīng)Thrombin凝血酶酶切過夜，再經(jīng)過柱純化后獲得不含GST且具有生物活性的HPT純蛋白，所得蛋白純度>90％。MALDI-TOF-MS分析表明，HPT蛋白分子量為39.4kD。用HPT純蛋白

8、免疫家兔，制備了高效價的多克隆抗體，進而構(gòu)建了雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測方法，其靈敏度為0.31ng·mL-1。利用該方法可以檢測轉(zhuǎn)基因植物組織中微量的HPT蛋白。 3．克螟稻CrylAb蛋白的表達、分泌與根際土中的殘留特性 分蘗始期至成熟期，KMD地上部和根中CrylAb蛋白的表達量分別為3.23～8.22μg·g-1FW和0.68～0.89μg·g-1FW；KMD根系分泌的CrylAb蛋白量僅為1.66～48.02ng/簇

9、·天；KMD根際土中的CrylAb蛋白殘留量低于檢測限(0.5ng·g-1air-driedsoil)，這表明田間種植條件下生育期間中的CrylAb蛋白不易轉(zhuǎn)移到根際土壤中?？紤]到KMD地上部相對較高的蛋白表達量(μg級)，因此應(yīng)該盡量避免KMD秸稈還田。 4．CrylAb純蛋白在腐殖酸、膨潤土、高嶺石及不同土壤中的吸附解吸規(guī)律 CrylAb蛋白與腐殖酸、膨潤土和高嶺石的吸附解吸動態(tài)。高嶺石、膨潤土和腐殖酸對CrylAb

10、蛋白的吸附量分別為131.27～1731.44ng·g-1、107.09～1846.42ng·g-1和78.02～1066.10ng·g-1，它們相應(yīng)的吸附率分別為41.34～79.95％、26.60～69.90％和30.34～45.83％。這3種吸附劑對CrylAb蛋白的吸附量隨添加濃度的增加而增加，而吸附率卻隨蛋白添加濃度呈相反變化趨勢。對CrylAb蛋白的吸附能力大小依次為高嶺石>膨潤土>腐殖酸，而解吸附能力大小為腐殖酸>高嶺石>

11、膨潤土。 CrylAb蛋白與不同土壤的吸附解吸動態(tài)。CryIAb純蛋白在供試的5種土壤中的吸附率隨添加濃度的增加而下降。濃度為782.55ng·mL-1和125.64ng·mL-1的CrylAb蛋白時小粉土的吸附率均為最高，分別是24.85％和40.81％；而黃松土和濱海鹽土的吸附率相對最低，分別是9.12％，31.67％和12.47％，30.75％。解吸附率隨著吸附量的減少而降低。小粉土的解吸附率比較低，分別是12.95％和5

12、.88％。 5．CrylAb純蛋白和KMD秸稈在土壤及水體中的降解規(guī)律 CrylAb純蛋白在水溶液和土壤中的降解。CrylAb純蛋白在溶液(pH 4.0～8.0)中的水解與溶液pH成負相關(guān)，與蛋白濃度成正相關(guān)。好氣條件下，CrylAb純蛋白的添加培養(yǎng)試驗表明，在5種不同土壤中其降解趨勢符合一級動力學(xué)反應(yīng)方程C=C0exp(-kt)，半減期為19.6～41.3d，主要是生物降解，與土壤的單一因子無顯著相關(guān)性。相比之下，Cr

13、ylAb蛋白在淹水土壤中的降解速度較慢，半減期要長得多，為45.9～141d。這就表明厭氧條件下，轉(zhuǎn)基因作物表達的CrylAb蛋白相對穩(wěn)定。 KMD秸稈在土壤中的降解動態(tài)。在好氣培養(yǎng)的90d內(nèi)KMD秸稈在土壤中的降解動態(tài)顯著符合以下方程C=C<,0>exp(-kt)。他們的可提態(tài)CrylAb蛋白的半減期的變化從11.5～34.3d。蛋白降解最快的土壤是堿性土。相反地，蛋白降解速率較慢的土壤是酸性土，他們是半減期為34.3d的黃金

14、泥和123.9d的紅砂土。進一步的試驗表明，黃松土中添加不同比例的KMD秸稈后CrylAb蛋白的降解也符合一級動力學(xué)方程。分別添力N3％、4％和7％KMD秸稈時，蛋白降解半減期分別是9.9d、13.8和18d。由此可知，隨著秸稈添加量的增加，CrylAb蛋白在土壤中的半減期有相應(yīng)的延長。在淹水條件下培養(yǎng)60d的秸稈中CrylAb蛋白降解也顯著符合動力學(xué)方程。秸稈中的CrylAb蛋白在酸性土壤，黃金泥和紅砂土中降解較慢，其半減期分別為70

15、.0d和61.3d。而在中性或堿性土中降解速度較快，半減期為43.9d。 6．KMD中HPT蛋白和/或NPTⅡ蛋白的表達、根系分泌動態(tài)及根際土殘留特性 不同生育期的KMD地上部與根部的HPT蛋白含量分別約為24.59～60.12ng·g-1 FW和15.67～33.13ng·g-1FW，相應(yīng)的NPTⅡ蛋白含量分別為1.61～2.99ng·g-1FW和3.86～9.97ng·g-1Fw。其精米中HPT蛋白含量約為5.28n

16、g·g-1DW，而NPTⅡ蛋白未檢出。這意味著它們不會導(dǎo)致致敏性，可能不會直接對人體健康造成危害。同時，KMD表達的NPTⅡ蛋白和HPT蛋白不易通過根系分泌途徑向土壤環(huán)境轉(zhuǎn)移，而且其根際土中也未檢出NPTⅡ蛋白。因此，田問種植的KMD不會導(dǎo)致HPT蛋白和/或NPTⅡ蛋白的嚴重積累，這也就預(yù)示著HPT蛋白和/或NPTⅡ蛋白不會直接對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境構(gòu)成威脅。 7．重金屬污染區(qū)KMD中元素吸收和積累的變化初探 本論文研究了在Cd

17、、Cu、Pb和Zn脅迫條件下，KMD和親本對Al、As、Ca、趴Cd、Co、Cr、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Zn15種元素的吸收和積累。發(fā)現(xiàn)在四種污染條件下，KMD和親本對這15種元素的吸收和積累規(guī)律既存在相似性也存在明顯的差異。尤其在Cd濃度為5、10和20mg·kg<'-1>soil的污染條件下，KMD糙米中Cd含量分別達到0.68±0.02、0.68±0.04和1.45±0.09mg·kg<'-1>，均已超過了