海水養(yǎng)殖魚(yú)類主要細(xì)菌病多聯(lián)疫苗的研制及應(yīng)用.pdf

1、隨著集約化、高密度養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，海水魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)遭受各種魚(yú)類疾病暴發(fā)的困擾，嚴(yán)重影響了海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。其中細(xì)菌性魚(yú)病是危害養(yǎng)殖魚(yú)類的一類主要疾病，每年給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。多年來(lái)一直使用廣譜抗生素和化學(xué)藥物進(jìn)行魚(yú)類細(xì)菌病害的防治，致使病原菌的抗藥性增加，且藥物殘留對(duì)水環(huán)境的污染日益嚴(yán)重，另外，藥物殘留還會(huì)對(duì)人體構(gòu)成潛在的威脅。本論文針對(duì)海水魚(yú)類頻繁發(fā)生的細(xì)菌性疾病，進(jìn)行了主要海水魚(yú)類致病菌的優(yōu)化培養(yǎng)、在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了鰻弧菌、

2、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌多聯(lián)滅活疫苗研制，并進(jìn)行了多聯(lián)疫苗對(duì)大菱鲆的免疫研究以及大腸桿菌表達(dá)的鰻弧菌外膜蛋白對(duì)海水養(yǎng)殖牙鲆的研究。 分別進(jìn)行了鰻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌的優(yōu)化培養(yǎng)，測(cè)定了不同溫度、鹽度、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)基成分配比對(duì)四種病原菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，鰻弧菌培養(yǎng)的最佳條件是：培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)鹽度低于20，培養(yǎng)基初始pH范圍在6.0～8.0。哈維氏弧菌培養(yǎng)的最佳條件是：溫度為2

3、8℃、鹽度為10～30、pH為5.0～9.0。副溶血弧菌的適宜繁殖溫度為28℃、鹽度為20～40、pH值為7.0～9.0。遲緩愛(ài)德華氏菌的適宜生長(zhǎng)條件是：溫度30℃、鹽度10～20、pH6.0～7.0。 制備了大菱鲆常見(jiàn)病原菌鰻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌的聯(lián)合疫苗，進(jìn)行了大菱鲆的免疫研究。對(duì)海水養(yǎng)殖大菱鲆進(jìn)行腹腔注射免疫，14天后用同樣方法加強(qiáng)免疫一次，定期采血測(cè)定抗體凝集效價(jià)，70 d后分別用10 <'6>-

4、10<'8> CFU/mL的鰻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌腹腔注射感染免疫魚(yú)。結(jié)果表明在免疫7 d后大菱鲆血清中產(chǎn)生了四種病原菌的特異性抗體，并且在21～57 d內(nèi)達(dá)到高峰，鰻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌的最高抗體效價(jià)分別是2<'8.17>、2<'7.07>、2<'6.85>和2<'8.81>，在70 d時(shí)4種菌的特異性抗體仍維持較高水平，分別是2<'7.85>、 2<'6.49>、2<'4.95>和2<

5、'8.14>。70 d時(shí)鰻弧菌、哈維氏弧菌人工感染大菱鲆的免疫保護(hù)力分別為66.67％、44.44％，而副溶血弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌感染的免疫保護(hù)力分別為20.00％和8.33％。 制備了大腸桿菌表達(dá)的致病性鰻弧菌外膜蛋白，SDS-PAGE分析表明表達(dá)蛋白分子量約38kDa，Western blot分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白能與鰻弧菌外膜蛋白抗體很好的反應(yīng)。用不同劑量表達(dá)的鰻弧菌外膜蛋白對(duì)牙鲆進(jìn)行了腹腔注射免疫研究，于28d后用鰻弧菌懸液(