ELISPOT和IP-10檢測用于結(jié)核病診斷的研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的可侵犯全身多系統(tǒng)多器官的疾病。近年來,由于HIV感染流行、耐藥結(jié)核的產(chǎn)生、人口流動(dòng)和免疫抑制劑的應(yīng)用增多等原因,全球結(jié)核病疫情進(jìn)一步加重,每年約有800萬新發(fā)結(jié)核病患者,有300萬人死于結(jié)核病,結(jié)核病是引起死亡的第二大感染性疾病。我國現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核病人約500萬,每年約有13萬人死于結(jié)核病。結(jié)核病的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是在痰、體液和/或病理樣本中找到結(jié)核分枝桿菌。痰菌陽性的肺結(jié)核病人是結(jié)核病的主要傳染源,但活動(dòng)性

2、肺結(jié)核病人中約有74％表現(xiàn)為痰菌陰性,缺乏診斷的金指標(biāo),容易與肺部常見疾病(如細(xì)菌性肺炎和支氣管肺癌)混淆。結(jié)核性腦膜炎屬于重癥結(jié)核,能否早期診治對其預(yù)后意義重大,但臨床上,能從細(xì)菌學(xué)或病理學(xué)上確診結(jié)核性腦膜炎(TBM)的可能性低下,診斷困難。誤診或診斷延遲不僅造成個(gè)體預(yù)后不佳,同時(shí)增加群體結(jié)核病患病的壓力。
　　機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后,體內(nèi)產(chǎn)生記憶性的T淋巴細(xì)胞(主要是Th1細(xì)胞),再次接觸結(jié)核桿菌特異性抗原時(shí)產(chǎn)生和分泌IFN-

3、γ。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)是一種IFN-γ釋放試驗(yàn)(IGRA),其較為成熟的方法是T-SPOT.TB試驗(yàn),試劑盒已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床,CDC為其制定了使用指南。ELISPOT通過計(jì)數(shù)有效釋放IFN-γ的細(xì)胞,可以發(fā)現(xiàn)Mtb的潛伏感染、輔助診斷活動(dòng)性結(jié)核病。應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌所特有的ESAT-6、CFP-10作為刺激抗原,不受卡介苗和非結(jié)核分枝桿(NTM)菌感染的影響,因此許多實(shí)驗(yàn)證明ELISPOT不僅能夠證實(shí)結(jié)核分枝桿菌

4、感染的存在,而且對肺結(jié)核診斷具有較高的特異性和一定的敏感性。研究顯示結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞有向病變部位集中的特點(diǎn),感染局部的體液中可能存在比較多的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞,因此我們推測,應(yīng)用ELISPOT方法檢測腦脊液,將提高結(jié)核性腦膜炎的診斷效率。本研究通過ELISPOT檢測腦脊液和血中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù),并與抗酸桿菌涂片、分枝桿菌培養(yǎng)、熒光定量PCR、結(jié)核抗體檢測等臨床檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果表明ELISPOT檢測腦脊液細(xì)胞具有較高的

5、敏感性和特異性,聯(lián)合檢測血和腦脊液ELISOPT能夠提高診斷效率,可以作為結(jié)核性腦膜炎的輔助診斷方法,為結(jié)核性腦膜炎的早期診斷治療提供依據(jù)。
　　IP-10是由IFN-γ或脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種趨化因子,屬于趨化因子CXC亞家族,在炎癥部位對淋巴細(xì)胞的活化和趨化起重要作用。IP-10的表達(dá)與IFN-γ的水平密切相關(guān),作為IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的下游趨化因子,能夠顯著地?cái)U(kuò)大IFN-γ的信號功能,有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌特異性肽融合抗原刺激肺

6、結(jié)核患者的PBMCs能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高濃度的IP-10。Ruhwald等人報(bào)道聯(lián)合檢測IP-10等因子,能夠提高干擾素釋放試驗(yàn)的敏感性。本研究用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原肽(ESAT-6、CFP-10)刺激活動(dòng)性肺結(jié)核和肺部常見疾病(細(xì)菌性肺炎和支氣管肺癌)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞,檢測結(jié)核分枝桿菌抗原特異反應(yīng)性IP-10水平,結(jié)果提示聯(lián)合檢測結(jié)核分枝桿菌抗原特異反應(yīng)性IP-10和IFN-γ,能夠顯著提高結(jié)核病診斷敏感性和特異性,可以作為肺結(jié)核的一

7、種輔助診斷方法。
　　目的:
　　研究IFN-γ釋放試驗(yàn)(ELISPOT方法)對結(jié)核性腦膜炎的診斷價(jià)值;研究結(jié)核分枝桿菌抗原特異反應(yīng)性IP-10和IFN-γ對肺結(jié)核的診斷價(jià)值。
　　方法:
　　1.利用ELISPOT檢測腦膜炎患者腦脊液和血中Mtb抗原特異性的IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)量。
　　2.采用FlowCytomix流式技術(shù)檢測肺結(jié)核和其他常見肺部疾病患者的PBMCs培養(yǎng)上清中特異性抗原反應(yīng)性IP-10和

8、IFN-γ的濃度。
　　3.收集并記錄腦脊液抗酸染色涂片、分枝桿菌培養(yǎng)、熒光定量PCR、結(jié)核抗體檢測的結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1.腦脊液ELISPOT檢測的敏感度為67.3%,特異度為89.2%,符合率為73.3%,PV+值為94.3%,對結(jié)核性腦膜炎具有較高的臨床診斷價(jià)值。
　　2.血ELISPOT檢測的敏感度為85.9%,特異度為41.9%,符合率為74.1%,PV+值為80.2%。比較血和腦脊液ELISPO

9、T檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)血液檢測特異度較低,考慮與非結(jié)腦患者合并腦外結(jié)核相關(guān)。
　　3.聯(lián)合檢測腦脊液和外周血T-SPOT.TB敏感性為91.1%,特異性96.4%。
　　4.分別比較腦脊液ELISPOT檢測與結(jié)核抗體、熒光定量PCR、抗酸桿菌染色和分枝桿菌培養(yǎng)檢測的結(jié)果,結(jié)果表明腦脊液ELISPOT檢測敏感性顯著高于其他檢測(P<0.05)。
　　5.采用FlowCytomix技術(shù)檢測外周血PBMCs培養(yǎng)上清中的IP-10和

10、IFN-γ的濃度,結(jié)果表明肺結(jié)核組顯著高于正常對照組和常見肺病組。
　　6.肺結(jié)核患者PBMCs經(jīng)結(jié)核抗原刺激后IP-10和IFN-γ濃度呈正相關(guān);聯(lián)合檢測IP-10和IFN-γ能夠顯著提高診斷肺結(jié)核的敏感性和特異性。
　　結(jié)論:
　　1.腦脊液ELISPOT檢測在結(jié)核性腦膜炎診斷具有較高的敏感性和特異性,可以作為結(jié)核性腦膜炎的輔助診斷,有利于早期診斷結(jié)核性腦膜炎。聯(lián)合腦脊液與血的ELISPOT檢測能提高結(jié)核性腦膜炎診