SM22α調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的血管生理及病理學(xué)效應(yīng)的機(jī)制.pdf

1、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要效應(yīng)因子，是一種多功能的血管活性肽。通過(guò)活化多條信號(hào)通路，參與心血管系統(tǒng)生理功能的調(diào)節(jié)，并介導(dǎo)多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程。AngⅡ急性刺激可誘導(dǎo)血管收縮，升高血壓;而長(zhǎng)時(shí)間慢性刺激可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、肥大及衰老。
　　SM22α又被稱為transgelin，是一種

2、平滑肌分化標(biāo)志物，高表達(dá)于哺乳動(dòng)物平滑肌中，被廣泛用于平滑肌細(xì)胞的鑒定。SM22α的主要功能是與actin結(jié)合，促進(jìn)actin細(xì)絲聚合及捆綁。我室以往的研究證實(shí)，SM22α通過(guò)促進(jìn)actin纖維聚合成束，進(jìn)而增強(qiáng)VSMC收縮性;此外，SM22α還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活性。然而，SM22α是否參與收縮信號(hào)分子活性的調(diào)節(jié)以及分子機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞內(nèi)SM22α蛋白水平與VSMC的表型狀態(tài)密切相關(guān)，絲裂原和炎性因子

3、可誘導(dǎo)該蛋白表達(dá)下調(diào)。然而，在多種衰老細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)SM22α表達(dá)上調(diào)，該蛋白已成為非肌細(xì)胞衰老的新標(biāo)志物。但是，SM22α是否參與VSMC衰老的調(diào)節(jié)，尚缺乏深入的研究。本研究主要探討SM22α在AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC收縮及衰老中的作用。
　　方法:
　　本研究利用SM22α基因敲除小鼠經(jīng)背皮下植入AngⅡ微滲透泵復(fù)制高血壓模型，用智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)檢測(cè)小鼠血壓，在整體水平探討病理情況下SM22α與血壓的關(guān)系;用微血管張力測(cè)定儀檢

4、測(cè)血管環(huán)等長(zhǎng)張力;用細(xì)胞長(zhǎng)度測(cè)量和膠原膠收縮分析分別檢測(cè)細(xì)胞收縮性;通過(guò)敲低SM22α及特異性信號(hào)通路阻斷劑，確定受其調(diào)節(jié)的信號(hào)途徑及靶分子;用RT-PCR、Western blot檢測(cè)mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)變化;用免疫共沉淀分析和免疫雙熒光染色確定蛋白質(zhì)相互作用;用免疫沉淀分析蛋白質(zhì)泛素化修飾;用AngⅡ慢性刺激建立VSMC衰老模型，探討SM22α在AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC衰老中的作用。
　　結(jié)果:
　　1 SM22α通過(guò)調(diào)節(jié)

5、ERK1/2活性參與AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC收縮
　　1.1 SM22α促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌收縮
　　選雄性Sm22α+/+及Sm22α-/小鼠復(fù)制高血壓小鼠模型。植泵前，Sm22α+/+小鼠的收縮壓和舒張壓分別為（118.8±2.2）和（76.4±2.7）mmHg，Sm22α-/-小鼠的收縮壓和舒張壓分別為（111.7±1.9）和（72.5±2.4）mm Hg，二者的基礎(chǔ)血壓無(wú)顯著差異。植泵后，兩種基因型小鼠的收縮壓

6、和舒張壓均隨著時(shí)間逐步升高，至21天時(shí)，Sm22α+/+小鼠的收縮壓和舒張壓分別為（179.5±2.3）和（130.5±2.8）mm Hg，Sm22α-/-小鼠的收縮壓和舒張壓分別為（158.3±1.8）和（109.3±3.1）mm Hg。Sm22α-/-小鼠的血壓顯著低于Sm22α+/+小鼠(P＜0.05)。
　　取小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行血管環(huán)張力測(cè)定，繪制主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)AngⅡ的濃度-收縮曲線，結(jié)果表明，AngⅡ可誘發(fā)兩種基因型小鼠的

7、主動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生明顯的收縮應(yīng)答。但是，Sm22α-/-小鼠主動(dòng)脈環(huán)的收縮反應(yīng)性較Sm22α+/+小鼠明顯減弱，表現(xiàn)為濃度-收縮曲線明顯右移，半數(shù)有效濃度(EC50)由5.57 nmol/L右移至12.13 nmol/L(P＜0.05);收縮峰值降低，在Sm22α+/+小鼠的主動(dòng)脈環(huán)中，AngⅡ引起的收縮峰值為45.5±4.3％，而Sm22α-/-小鼠的主動(dòng)脈環(huán)的收縮峰值為28.4±4.0％(P＜0.05)。敲低SM22α后，AngⅡ誘導(dǎo)的V

8、SMC長(zhǎng)度變化百分比及膠原膠面積變化百分比均顯著降低(P＜0.05)。并且Sm22α-/-小鼠VSMC對(duì)AngⅡ的收縮性顯著降低。
　　1.2 ERK1/2通路介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌收縮
　　AngⅡ刺激2 min時(shí)，ERK1/2的磷酸化水平即有顯著升高，5 min時(shí)達(dá)高峰;其下游靶蛋白caldesmon磷酸化時(shí)程與ERK1/2基本一致。細(xì)胞長(zhǎng)度變化百分比于AngⅡ刺激5 min后達(dá)峰值，時(shí)程與ERK1/2磷酸化基本一

9、致。PD98059預(yù)孵育2h后，AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化受到顯著抑制，伴隨caldesmon的磷酸化水平顯著降低。用PD98059預(yù)處理小鼠主動(dòng)脈環(huán)30 min后，AngⅡ誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)顯著降低。濃度-收縮曲線明顯右移（EC50為8.90 nmol/L）;收縮峰值由43.4±4.1％降至32.5±4.2％。在細(xì)胞水平，PD98059預(yù)處理后，AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC長(zhǎng)度變化百分比及膠原膠面積變化百分比均顯著降低。
　　1.3

10、 SM22α調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2激活
　　用小干擾RNA敲低內(nèi)源性SM22α后，觀察AngⅡ短時(shí)間(5 min)刺激，ERK1/2的活化情況。結(jié)果表明，AngⅡ刺激后，對(duì)照組及SM22α敲低組ERK1/2磷酸化水平均有升高，但SM22α敲低組的上升幅度顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。AngⅡ刺激5 min后，原代培養(yǎng)的Sm22α-/-組VSMC的ERK1/2磷酸化水平較Sm22α+/+組顯著降低。
　　2 SM22

11、α通過(guò)促進(jìn)MKP3降解調(diào)節(jié)AngⅡ-ERK1/2通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　2.1 SM22α通過(guò)MKP3調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2通路活化
　　AngⅡ刺激5 min后，SM22α敲低組及對(duì)照組MEK磷酸化水平均有顯著升高，但兩組的升高幅度并無(wú)顯著差異。而在敲低SM22α后，其磷酸酶MKP3的表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)伴有AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化減弱。Sm22α-/-小鼠血管組織中MKP3的表達(dá)水平較Sm22α+/+小鼠顯著升高

12、。用MKP3抑制劑BCI(10μmol/L)預(yù)孵育30 min可逆轉(zhuǎn)敲低SM22α對(duì)ERK1/2通路活化的抑制作用。
　　2.2 MKP3通過(guò)抑制ERK1/2參與AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌收縮
　　BCI預(yù)處理后，小鼠主動(dòng)脈對(duì)AngⅡ的收縮應(yīng)答顯著增強(qiáng)，濃度-收縮曲線明顯左移（EC50為3.83 nmol/L）;收縮峰值由46.1±3.8％升至61.1±5.1％。在細(xì)胞水平，BCI(10μmol/L)預(yù)孵育2h后，AngⅡ誘導(dǎo)

13、的VSMC長(zhǎng)度變化百分比及膠原膠面積變化百分比均顯著增加(P＜0.05)。與GFP空質(zhì)粒對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)GFP-MKP3后，AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC長(zhǎng)度變化百分比及膠原膠面積變化百分比均顯著降低。BCI(10μmol/L)預(yù)孵育2h后，ERK1/2及caldesmon的磷酸化水平顯著升高;而過(guò)表達(dá)GFP-MKP3融合蛋白后，與轉(zhuǎn)染GFP空質(zhì)粒的VSMC相比，ERK1/2及caldesmon的磷酸化水平顯著降低。
　　2.3 SM2

14、2α抑制MKP3與ERK1/2的相互作用
　　免疫共沉淀結(jié)果顯示，在未刺激時(shí)，MKP3與ERK1/2即有較弱的相互作用;敲低SM22α后，MKP3與ERK1/2的結(jié)合量顯著增加。與Sm22α+/+小鼠相比，Sm22α-/-小鼠VSMC中二者的相互作用增強(qiáng)。細(xì)胞免疫熒光染色分析結(jié)果顯示，敲低SM22α后，細(xì)胞內(nèi)MKP3熒光強(qiáng)度及其與ERK1/2的共定位均顯著增加。
　　2.4 SM22α促進(jìn)MKP3的泛素-蛋白酶體降解過(guò)程

15、r>　　敲低SM22α后，VSMC中MKP3的mRNA水平并無(wú)顯著改變，并且Sm22α+/+與Sm22α-/-兩種基因型小鼠主動(dòng)脈組織中MKP3的mRNA水平也無(wú)顯著差異。用放線菌酮阻斷新生蛋白質(zhì)合成，測(cè)定蛋白質(zhì)半壽期。結(jié)果表明，MKP3半壽期很短，約為30 min左右;90 min時(shí)，蛋白降解明顯。敲低SM22α后，MKP3的半壽期延長(zhǎng)至90 min以上。用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞，觀察對(duì)MKP3半壽期的影響。結(jié)果顯示，MG1

16、32（10μmol/L）預(yù)處理2h可顯著延長(zhǎng)MKP3的半壽期。泛素化分析結(jié)果顯示，敲低SM22α后，MKP3的泛素化水平顯著降低。
　　3 SM22α促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC衰老
　　3.1 SM22α在AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC衰老中表達(dá)上調(diào)
　　AngⅡ刺激3天后VSMC中SA-β-gal陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比為5.4±1.4％，與對(duì)照組（6.5±1.6％）相比，無(wú)顯著差異;刺激5天，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞百分比為43

17、.9±5.3％，顯著高于對(duì)照組（22.1±4.1％，P＜0.05），刺激7天和10天，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大幅度增加，陽(yáng)性細(xì)胞百分比高達(dá)78.9±5.2％及92.3±4.4％。AngⅡ刺激7天及10天，p21和p53的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，并且表達(dá)量隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而升高;相反，PCNA的表達(dá)隨刺激時(shí)間逐漸降低。AngⅡ刺激5天后，SM22α的表達(dá)表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，并隨AngⅡ刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增加。

18、r>　　3.2 AngⅡ上調(diào)SM22α基因轉(zhuǎn)錄活性
　　AngⅡ刺激3天，SM22α的mRNA水平開(kāi)始升高，與刺激前相比，約升高3.8倍;至10天時(shí)達(dá)到峰值，約為刺激前的12.1倍，與其蛋白水平變化一致。而AngⅡ刺激不同時(shí)間，SM22α的泛素化水平?jīng)]有顯著改變。
　　3.3 SM22α促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC衰老
　　在VSMC中敲低SM22α，觀察對(duì)細(xì)胞衰老的影響。敲低SM22α后，AngⅡ誘導(dǎo)的SA-β-gal

19、陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為25.3±4.3％和32.3±4.6％較對(duì)照組（79.2±4.2％及89.2±5.2％）顯著降低(P＜0.05)。并且，衰老標(biāo)志蛋白p21及p53的表達(dá)顯著減少，而增殖標(biāo)志PCNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.SM22α通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1/2通路活化參與AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌收縮。
　　2.SM22α通過(guò)促進(jìn)MKP3的泛素-蛋白酶體降解和抑制MKP3與ERK1/2的相互作用，進(jìn)而調(diào)