siRNA靶向沉默PPARγ及PPARα對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲力的影響.pdf

1、背景與目的:隨著對(duì)PPARs基因的深入了解，PPARγ在腫瘤中的作用日益成為學(xué)者們研究的焦點(diǎn)，有不少研究證明，其激動(dòng)劑在體外研究中能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但是在體內(nèi)研究和臨床研究中并不能取得相應(yīng)的效果，特別是在PPARγ表達(dá)陽性的腫瘤中效果不明顯。為此，本研究選擇PPARγ陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系KLE與HEC-1A細(xì)胞，利用RNA干擾技術(shù)，抑制PPARγ的表達(dá)，意在尋找治療PPARγ高表達(dá)腫瘤的一種更好的方法。 方法: （1

2、）PPARγ及α干擾RNA質(zhì)粒的構(gòu)建依據(jù)Katherine L.Schaefer等人的實(shí)驗(yàn)選擇干擾的靶點(diǎn)，依據(jù)選定的特異序列分別合成兩條DNA單鏈，退火后插入已酶切線性化的載體中，形成重組質(zhì)粒。采用通用型陰性對(duì)照序列同法構(gòu)建陰性對(duì)照載體。 （2）質(zhì)粒的擴(kuò)增及鑒定質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用于酶切鑒定和測(cè)序。 （3）細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染KLE細(xì)胞與HEC-1A細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染過程按照lipofect

3、amine2000說明書操作。轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染效率。 （4）Western blotting檢測(cè)干擾RNA的沉默效率轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，目的條帶用AlphaEaseFC軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。PPARγ條帶與actin條帶吸光度的比值表示蛋白表達(dá)量，干擾質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞目的蛋白表達(dá)的抑制率為（1-轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)的量/轉(zhuǎn)染空載

4、體表達(dá)的量）×100％。 （5）四唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)測(cè)定PPARγ干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE和HEC-1a細(xì)胞株生長的抑制作用分別設(shè)空白對(duì)照組、陰性質(zhì)粒組、重組干擾質(zhì)粒組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。以轉(zhuǎn)染后24、48、72、96小時(shí)為時(shí)間點(diǎn)，在酶標(biāo)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光值，紀(jì)錄結(jié)果。抑制率=（1-處理組/空白對(duì)照組）×100％。 （6）Hoecht3222染色法檢測(cè)PPARγ干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE和HEC-1a細(xì)胞株的

5、凋亡誘導(dǎo)作用轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，Hoech3222染色，于熒光倒置顯微鏡下觀測(cè)胞核變化。分別取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)凋亡變化的細(xì)胞個(gè)數(shù)所占比例為凋亡率，取平均值，并與陰性對(duì)照組細(xì)胞做比較。 （7）Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PPARγ干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE和HEC-1a細(xì)胞株侵襲力的影響構(gòu)建體外侵襲試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的細(xì)胞，種于transwell小室的上室，孵育24小時(shí)后觀察HE染色觀察侵襲的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算侵襲率與對(duì)

6、照組細(xì)胞進(jìn)行比較。 （8）四唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)檢測(cè)PPARa干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長抑制作用方法參照“四唑鹽比色試驗(yàn)檢測(cè)PPARγ干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長抑制”。 （9）四唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)檢測(cè)PPARα干擾質(zhì)粒與PPARγ干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的影響將轉(zhuǎn)染PPARγ干擾質(zhì)粒的KLE細(xì)胞、HEC-1a細(xì)胞行G418篩選后得到穩(wěn)定細(xì)胞株，分別以1.5×105/ml及5×105/ml密度接種于96

7、孔板，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒PPARα及陰性對(duì)照質(zhì)粒，空白對(duì)照組只加入無血清的培養(yǎng)基。具體方法參照“四唑鹽比色試驗(yàn)檢測(cè)PPARγ干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長抑制”。 （10）Hoecht3222染色法檢測(cè)PPARα干擾質(zhì)粒與PPARγ干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響將穩(wěn)篩后的KLE細(xì)胞、HEC-1a細(xì)胞以1.5×105/ml及5×105/ml密度接種于6孔板，CO2孵箱終培養(yǎng)，在37℃、5％CO2基飽和濕度條件下，培養(yǎng)

8、24h后轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒PPARα及陰性對(duì)照質(zhì)粒，空白對(duì)照組只加入無血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)Hoecht3222染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。具體方法參照“Hoecht3222染色法檢測(cè)PPARγ干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響”。 結(jié)果: （1）轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的轉(zhuǎn)染效率在兩種細(xì)胞種分別可到達(dá)69.8％±0.199，70.1％±0.077。 （2）轉(zhuǎn)染48小時(shí)后PPARγ干擾片段的沉默效率分別為62.9％±0.033，72.9

9、％±0.102； PPARα干擾片段的沉默效率分別為40.28％±0.0123，55.29％±0.02486。 （3）PPARγ干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株KLE及HEC-1a生長抑制作用呈時(shí)間依賴性。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，細(xì)胞生長抑制作用與對(duì)照組相比無明顯差異。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別；72小時(shí)后，細(xì)胞生長出現(xiàn)明顯的抑制。 （4）PPARγ干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株KLE及HEC-1a細(xì)胞凋亡的影響PPARγ干擾質(zhì)粒

10、轉(zhuǎn)染細(xì)胞在60小時(shí)已出現(xiàn)早期核凋亡改變，核膜皺縮，成波浪狀，染色體凝集成塊狀。72小時(shí)，凋亡細(xì)胞明顯增多，KLE細(xì)胞干擾組與對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HEC-1-A：干擾組與陰性對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 （5）Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PPARγ干擾質(zhì)粒對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE和HEC-1a細(xì)胞株侵襲力的降低。KLE、HEC-1-A細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)與空白對(duì)照組及陰性對(duì)

11、照組相比，干擾組的侵襲率明顯減少，KLE細(xì)胞：X2=93.32，v=1，P<0.05； HEC-1a細(xì)胞：X2=1.834，v=1，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 （6）PPARα干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KLE及HEC-1a細(xì)胞株后，生長抑制作用不明顯。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，對(duì)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及干擾組的吸光度行方差分析， KLE細(xì)胞：F=2.198，P=0.123，P>0.05，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而HEC-1a細(xì)胞對(duì)PPARα干擾質(zhì)粒的反應(yīng)

12、同樣無明顯差異。 （7）PPARα干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)篩后的KLE細(xì)胞株時(shí)，干擾組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而PPARα干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)篩的HEC-1a細(xì)胞株時(shí)，干擾組與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 （8）轉(zhuǎn)染PPARα干擾質(zhì)粒后72小時(shí)，穩(wěn)篩的KLE及HEC-1a的干擾組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。穩(wěn)篩的KLE：干擾組與陰性對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；穩(wěn)篩的HEC-1a：干擾組與陰性對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

13、 結(jié)論: 1.PPARγ的下調(diào)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株KLE及HEC-1a的生長，此抑制作用呈時(shí)間依賴性。 2.PPARγ下調(diào)能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株KLE及HEC-1a的凋亡 3.PPARγ的下調(diào)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株KLE及HEC-1a侵襲的發(fā)生。 4.下調(diào)PPARα的表達(dá)，并沒有抑制腫瘤細(xì)胞生長或誘導(dǎo)凋亡，可能與選擇的干擾片斷效能有關(guān)，但同時(shí)下調(diào)PPARγ后，生長抑制作用明顯，說明PPARα及P