馬尾松(Pinusmassoniana)內(nèi)生真菌篩選培養(yǎng)及其在產(chǎn)油脂中的應(yīng)用.pdf

1、植物內(nèi)生真菌泛指那些在其整個生活史或生活史中的某一階段生活在植物組織內(nèi)部，對植物組織不引起明顯病害癥狀的一類真菌。植物內(nèi)生真菌在各種植物中都普遍存在，分布在根、莖、葉等器官表皮下的組織中。植物內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)生存，與宿主植物在長期演化中互惠互利，共同生長。前人對內(nèi)生真菌的生物學作用和內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物做了很多相關(guān)研究。研究表明，植物內(nèi)生真菌對宿主植物的生長有促進作用，能增強宿主植物對病蟲害的抵抗能力，提高宿主植物對生物脅迫和非生物

2、脅迫的抗性，在植物體內(nèi)能產(chǎn)生多種具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。同時，宿主植物與其內(nèi)生真菌長期共生，相互影響，大多數(shù)植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與其宿主相同或相似的活性成分。馬尾松栽植面積廣，是我國松屬（Pinus）樹種中重要的用材樹種，也是荒山造林的先鋒樹種。馬尾松富含松脂，是中國主要產(chǎn)脂樹種。關(guān)于馬尾松內(nèi)生真菌在產(chǎn)油脂中的應(yīng)用研究未見報道。
　　以馬尾松為研究對象，進行馬尾松內(nèi)生真菌的分離和鑒定，并作多樣性分析，運用馬尾松內(nèi)生真菌液體發(fā)酵

3、液進行微生物采脂研究、進行馬尾松內(nèi)生真菌對松脂產(chǎn)量影響的回歸分析、馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂效果研究及內(nèi)生真菌分子生物學鑒定。為馬尾松的綜合開發(fā)利用，進一步形成生產(chǎn)力提供技術(shù)依據(jù)。
　　主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、馬尾松各器官的樣品采自福建省漳平五一國有林場。經(jīng)表面消毒，從馬尾松根、莖、葉中分離得到102株內(nèi)生真菌。經(jīng)顯微形態(tài)觀察，歸屬為11個屬，分屬于6科6目4綱3門。表明馬尾松的內(nèi)生真菌種類具有豐富的多樣性。分離鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)

4、，內(nèi)生真菌分布在馬尾松的不同器官組織的菌株數(shù)量和種群上都存在較大差異，從葉器官分離到的內(nèi)生真菌株數(shù)和涉及屬的數(shù)量最多，莖部次之，根部最少。毛霉屬（Mucor）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）在根、莖、葉器官中都有分布，其它屬只分布在根、莖、葉中的某兩個器官組織中。曲霉屬（Aspergillus）、擬莖點霉屬（Phomopsis）、莖點霉屬（Phoma）和青霉屬（Pen

5、icillium）是馬尾松內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢屬。其余屬（鐮刀菌屬（Fusarium）、擬青霉屬（Paecilomyces）、生赤殼屬（Bionectria）、葉點霉屬（Phyllosticta）和叢梗孢屬（Monilia））菌株數(shù)相對較少，為非優(yōu)勢屬。
　　2、首次應(yīng)用馬尾松內(nèi)生真菌進行微生物采脂研究。從馬尾松根、莖、葉分離出的內(nèi)生真菌中選取十株優(yōu)勢菌株進行試驗。研究區(qū)位于福建省龍巖市新羅區(qū)小池鎮(zhèn)卓洋村。將10株馬尾松內(nèi)生真菌發(fā)酵液

6、及其組成的混合發(fā)酵液替代化學刺激劑分別涂刷于割溝進行微生物采脂。通過試驗，涂菌后的馬尾松平均單株單刀產(chǎn)脂量均高于涂菌前平均單株單刀產(chǎn)脂量，而混合發(fā)酵液形成的松脂增產(chǎn)率最高，為40.83％。
　　從該試驗的10株馬尾松內(nèi)生真菌中選取形成松脂增產(chǎn)率前3位的菌ZI41155、BS4787、FH0131進行試驗，研究不同菌種、不同胸徑和不同侵染次數(shù)對馬尾松松脂產(chǎn)量的影響。采用正交試驗設(shè)計方法，以菌種、胸徑和侵染次數(shù)為試驗因素，各因素取3個

7、水平，進行3因素3水平正交試驗。試驗結(jié)果表明，菌種、胸徑和侵染次數(shù)3種因素對松脂產(chǎn)量影響程度的大小有較大的差異。胸徑對松脂產(chǎn)量的影響程度最大，菌種次之，侵染次數(shù)對松脂產(chǎn)量的影響最小。在顯著水平α=0.01上，菌種對松脂增產(chǎn)率的影響極顯著。在顯著水平α=0.05上，侵染次數(shù)對松脂增產(chǎn)率的影響不顯著。菌ZI41155形成的松脂增產(chǎn)率均值最高，菌BS4787的次之，菌FH0131形成的松脂增產(chǎn)率均值最低。三個徑階中，松脂增產(chǎn)率均值隨胸徑的增大

8、而增大。三種侵染次數(shù)形成的松脂增產(chǎn)率均值隨侵染次數(shù)的增多而增大。
　　3、選取第二部分正交試驗得出的菌種因素中最優(yōu)水平菌ZI41155進行試驗。以胸徑為自變量，松脂增產(chǎn)率為因變量，研究用菌ZI41155發(fā)酵液進行微生物采脂時，形成的松脂增產(chǎn)率與胸徑的關(guān)系。隨機選取100株胸徑在18cm以上的馬尾松，將菌ZI41155的發(fā)酵液涂刷于馬尾松樹體割溝，進行微生物采脂試驗。根據(jù)最小二乘法的建模原理和方法，利用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對胸徑及松

9、脂增產(chǎn)率進行回歸分析，得到回歸方程：Y=-28.608+2.76X。經(jīng)方差分析及對回歸系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果均表明，所建立的回歸方程顯著，表明所建立的回歸方程有效。
　　4、首次進行馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂效果的研究。從第二部分試驗的10株馬尾松內(nèi)生真菌中選取形成松脂增產(chǎn)率前4位的菌ZI41155、BS4787、FH0131、BS18200進行試驗。用蘇丹黑染液對菌絲染色，在光學顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)四株內(nèi)生真菌菌絲中均有油滴存在。應(yīng)用酸熱

10、法提取油脂，測定油脂含量，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析油脂組分。結(jié)果表明：4株馬尾松內(nèi)生真菌油脂含量均達20%以上，最高含量達30.56%。4菌株都含有脂肪酸，且均占油脂提取物的64%以上，不飽和脂肪酸含量均達46％以上。油脂組分主要為棕櫚酸酯、硬脂酸、油酸、亞油酸、反油酸等，其中油酸含量最大，達42.08%。
　　5、對第四部分試驗的4株馬尾松產(chǎn)油脂內(nèi)生真菌ZI41155、BS4787、FH0131、BS182

11、00進行分子生物學鑒定。對4株馬尾松內(nèi)生菌產(chǎn)油脂菌株進行基因組DNA提取、PCR擴增、序列測定。將測序得到的基因序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫序列進行Blast分析，利用ClustalX2.1軟件對多個序列進行比對分析，應(yīng)用MEGA5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析，進行親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析。通過比對分析，結(jié)合其菌落形態(tài)特征，初步鑒定菌ZI41155為擬青霉屬（Paecilomyces）、菌BS4787為生赤殼菌屬（Bionectri