三明野生蕉和天寶蕉WHIRLY基因克隆及其定量表達(dá)分析.pdf

1、香蕉是世界重要水果之一，中國(guó)香蕉產(chǎn)量居第四位。香蕉作為世界重要水果，種質(zhì)資源相對(duì)缺乏。野生蕉為香蕉提供了很重要的種質(zhì)資源。野生香蕉為二倍體，可以進(jìn)行有性繁殖，抗逆性強(qiáng)。福建省分布有大量野生蕉，三明野生蕉分布于三明市山區(qū)，抗寒性較強(qiáng)。天寶蕉主要分布于閩南地區(qū)，為福建最著名的主栽品種，抗性較弱。WHIRLY（WHY）是轉(zhuǎn)錄因子，在植物防御反應(yīng)中起到有重要的作用。Whirly蛋白家族的成員貫穿于整個(gè)植物王國(guó)，具有可與單鏈DNA結(jié)合的能力。本實(shí)

2、驗(yàn)以三明野生蕉和天寶蕉為材料，克隆WHIRLY基因，并進(jìn)行在低溫、水楊酸和NaCl處理下的qPCR分析。
　　1.香蕉基因組WHIRLY家族基因基因結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析
　　馬來(lái)西亞小果野蕉（Musa acuminata,AA group）香蕉全基因組WHIRLY家族基因檢索結(jié)果獲得2個(gè)WHIRLY家族基因，只有一個(gè)為完整的CDS。一個(gè)位于6號(hào)染色體上，另一個(gè)位于9號(hào)染色體上。Why1位于6號(hào)染色體共有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子

3、。
　　生物信息學(xué)分析表明，香蕉基因組Why1屬于不穩(wěn)定、親水蛋白；保守結(jié)構(gòu)域分析表明Whirly基因家族包含植物Whirly轉(zhuǎn)錄因子；香蕉基因組Why1不具有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白；香蕉基因組Why1蛋白位于線(xiàn)粒體基質(zhì)可能性最大；Why1蛋白共有22個(gè)磷酸化位點(diǎn)，絲氨酸（Ser）位點(diǎn)有16個(gè)，蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)有5個(gè)，酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)有1個(gè)；Why1蛋白未形成卷曲螺旋；二級(jí)結(jié)構(gòu)表明Why1蛋白由主要結(jié)構(gòu)元件為無(wú)規(guī)則卷曲和β

4、折疊，α螺旋所占比例最小。
　　2.三明野生蕉和天寶蕉WHIRLY基因的克隆及其生物信息學(xué)分析
　　以三明野生蕉（Musa spp.,AB group）和天寶蕉（Musa spp.CV.Tianbaojiao,AAA group）葉片為材料提取RNA，利用RT-PCR結(jié)合RACE法，從三明野生蕉中分離得到Whirly家族三個(gè)成員，Why1有完整的ORF，開(kāi)放閱讀框?yàn)?55bp，編碼245個(gè)氨基酸，登錄號(hào)為KC127691，W

5、hy2和Why3只有保守區(qū)，登錄號(hào)分別為KJ957798和KJ957799；從天寶蕉中分離得到Why1具有完整的ORF，開(kāi)放閱讀框?yàn)?55bp，編碼245個(gè)氨基酸，登錄號(hào)為KJ637331。
　　生物信息學(xué)分析表明，三明野生蕉Why1屬于不穩(wěn)定、親水蛋白；保守結(jié)構(gòu)域分析表明Whirly基因家族包含植物Whirly轉(zhuǎn)錄因子；該蛋白不具有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白；該蛋白位于線(xiàn)粒體基質(zhì)的可能性最大；該蛋白共有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)，絲氨酸（Se

6、r）位點(diǎn)有19個(gè)，蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)有5個(gè)，酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)有1個(gè)；該蛋白未形成卷曲螺旋；二級(jí)結(jié)構(gòu)表明三明野生蕉Why1蛋白由主要結(jié)構(gòu)元件為無(wú)規(guī)則卷曲和β折疊，α螺旋所占比例最小；該蛋白與單子葉禾本科植物的玉米、高粱的親緣關(guān)系比較近，而與雙子葉木本薔薇科的蘋(píng)果和碧桃等植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　天寶蕉Why1蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白，屬于親水蛋白；保守結(jié)構(gòu)域分析表明Whirly基因家族包含植物Whirly轉(zhuǎn)錄因子；天寶蕉Why1蛋白

7、不具有信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，天寶蕉Why1蛋白位于線(xiàn)粒體和葉綠體的可能性最大。天寶蕉Why1蛋白屬于堿性蛋白，其中Ser、Val、Pro所占比重較大。二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成。二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大，α螺旋所占比例最小。
　　3.三明野生蕉和天寶蕉WHIRLY基因的定量表達(dá)分析
　　以28℃，20℃，13℃，4℃，0℃下處理36h的三明野生蕉cDNA為模板，Why1在不同溫度處理下出現(xiàn)2次

8、表達(dá)高峰，分別是20℃和4℃，Why1基因可能參與調(diào)控多個(gè)抗寒相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；不同溫度處理下Why2的表達(dá)模式與Why1相似，但是表達(dá)量相對(duì)較低，說(shuō)明Why1對(duì)不同溫度的反應(yīng)更敏感；8℃低溫處理下，Why1和Why2的表達(dá)模式相似，總體是被誘導(dǎo)的。因此WHIRLY可能參與了抗寒途徑的調(diào)控。在低溫8℃，SA處理下，Why1和Why2的表達(dá)模式相似，在4h時(shí)表達(dá)量低于對(duì)照組，其他時(shí)間表達(dá)量均高于對(duì)照組，Why1和Why2總體都是被誘導(dǎo)的；在

9、28℃和8℃SA處理下，三明野生蕉Why1和Why2表達(dá)量與溫度相關(guān)性不大，溫度對(duì)SA誘導(dǎo)三明野生蕉WHIRLY的表達(dá)還需進(jìn)一步研究。綜上所述，三明野生蕉WHIRLY基因可能參與了抗寒抗病、抗衰老、抗寒等相關(guān)抗逆途徑的調(diào)控。
　　天寶蕉Why1在4℃處理下總體來(lái)說(shuō)是被誘導(dǎo)的，但是并不是很顯著，推測(cè)Why1基因參與了天寶蕉的低溫響應(yīng)，在抗寒相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用；SA處理，在4h時(shí)天寶蕉Why1基因表達(dá)量達(dá)到峰值，表達(dá)