金花茶體胚調(diào)控及SERK基因的克隆與定量表達(dá)分析.pdf

1、本研究以金花茶成年莖段誘導(dǎo)的胚性培養(yǎng)物為材料，進(jìn)行體胚發(fā)生同步化調(diào)控和花狀多子葉形胚增殖系統(tǒng)的優(yōu)化；克隆金花茶體胚SERK基因，并采用實時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行金花茶體胚發(fā)生過程中SERK基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、金花茶體胚發(fā)生同步化調(diào)控與花藥胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
　　 以金花茶成年莖段誘導(dǎo)的胚性培養(yǎng)物為材料，進(jìn)行體胚發(fā)生同步化調(diào)控，結(jié)果表明：在C1:MS+4％蔗糖+2％山露醇+6％瓊脂和C2

2、:MS+4％蔗糖+2％甘露醇+6％瓊脂培養(yǎng)基上獲得球形胚和心形胚同步化材料，在人為挑選和培養(yǎng)基調(diào)控相結(jié)合的基礎(chǔ)上，獲得子葉胚和成熟胚材料。同時，進(jìn)行了金花茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)。結(jié)果表明：金花茶花蕾低溫4℃預(yù)處理24h，接種于MS+2.0mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1KT能誘導(dǎo)出愈傷組織，之后挑選愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基MS+1.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1IAA可觀察到白色愈傷組織分化為綠色的生長點，經(jīng)過篩選和形

3、態(tài)學(xué)觀察初步判斷為胚性愈傷組織。
　　 2、金花茶花狀多子葉形胚增殖系統(tǒng)的優(yōu)化
　　 本試驗研究了不同濃度甜菜堿、PEG6000、激素組合對花狀多子葉形胚的誘導(dǎo)影響。結(jié)果表明：在0.8g·L-1甜菜堿+20g·L-1甘露醇的MS培養(yǎng)基上，心形胚誘導(dǎo)花狀多子葉形胚的效果最好，達(dá)到了86.6％。同時還促進(jìn)次生胚的增殖；在PEG60007.5％+20g·L1甘露醇培養(yǎng)基上，花狀子葉胚的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到76.9％。從以上調(diào)控培養(yǎng)

4、基上誘導(dǎo)的花狀多子葉形胚中挑選較成熟的體胚轉(zhuǎn)移至Y0培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.2mg/L+BA2mg/L)，體胚由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，最后在變紅的胚體表面又生長出較同步的次生胚。將其重新接種到原來培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40d后就可以獲得花狀多子葉胚，可重復(fù)這一發(fā)育途徑。
　　 3、金花茶體胚SERK基因克隆
　　 以金花茶球形胚為材料，進(jìn)行SERK基因克隆。根據(jù)其他植物已知SERK基因序列設(shè)計引物，應(yīng)用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)，

5、獲得了金花茶體胚SERK基因cDNA的保守區(qū)和3’序列。該目的片段經(jīng)測序得到的長為1219bp，該序列與登錄GenBank其他植物SERK基因序列進(jìn)行核苷酸比對發(fā)現(xiàn)，同源性85％-73％左右；經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)金花茶體胚SERK基因編碼277個氨基酸，與GenBank其他植物SERK基因序列進(jìn)行氨基酸序列比對，同源性較高。這也證明了金花茶體胚SERK基因存在保守性。4金花茶體胚發(fā)生過程中SERK基因表達(dá)的實時熒光定量PCR分析