新型隱球菌抗-CAP10蛋白單克隆抗體制備及臨床感染檢測研究.pdf

1、近年來，新型隱球菌感染不斷增多，由其引起的隱球菌性腦膜炎也成為臨床腦膜炎的重要病原。新型隱球菌致病力主要由其細胞壁的多糖莢膜所介導，其中莢膜相關蛋白是莢膜形成的必須組分，在新型隱球菌感染的診斷和治療中具有重要作用，但目前對新型隱球菌致病機制及感染診斷仍然缺乏系統(tǒng)深入的研究。目前報道有四種與新型隱球菌致病相關的莢膜相關蛋白，其中的CAP10蛋白，是繼CAP59、CAP60、CAP64后于近年研究報道，目前未見針對該蛋白的免疫診斷和感染檢測

2、的研究報道。本研究針對新型隱球菌莢膜相關蛋白CAP10制備了特異性抗-CAP10的單克隆抗體，為臨床新型隱球菌的檢測和血清型分析奠定了基礎：同時對檢測新型隱球菌感染的兩種免疫學檢測方法在臨床診斷中的應用進行了比較分析，為臨床新型隱球菌感染的免疫學檢測提供重要的參考數(shù)據(jù)。
　　 1.新型隱球菌CAP10蛋白的重組表達及單克隆抗體制備：
　　 ①新型隱球菌CAP10蛋白的重組表達：采用生物信息技術對莢膜相關蛋白CAP10進行

3、抗原表位預測分析。分析結果發(fā)現(xiàn)，該蛋白S1區(qū)段(70-215aa片段)在隱球菌病主要致病菌(血清型A、D、AD)中保守性最高，S2區(qū)段(350-510aa片段)只識別格特隱球菌和部分新生隱球菌。為了在原核表達系統(tǒng)中進行有效表達，采用密碼子優(yōu)化技術優(yōu)化并合成了上述2個區(qū)段基因，克隆至原核表達載體pQE30中。轉化表達宿主菌后經誘導，成功表達出莢膜相關蛋白CAP10-1(70-215aa)重組蛋白。該重組蛋白分子量約為25kD，重組蛋白以包

4、涵體形式表達，經純化后獲得目的重組蛋白。
　　 ②抗-CAP10蛋白的單克隆抗體制備及鑒定：用純化的重組蛋白CAP10免疫Balb/c小鼠，經過2次免疫，血清抗體效價達到適當水平時進行細胞融合；經有限稀釋進行亞克隆和篩選后，得到11株分泌抗-CAP10的單克隆抗體細胞株。腹水中11株單抗效價大于1:50萬。對11株獲得的單克隆抗體通過ELISA檢測其特異性。將重組表達的CAP10-2(350-510aa)重組蛋白用作對照蛋白，同

5、時再分別以大腸桿菌裂解蛋白和購買的莢膜相關蛋白CAP59蛋白為對照抗原進行包被，采用間接ELISA法檢測制備的單克隆抗體。上述抗體只與CAP10-1重組蛋白反應；與莢膜相關蛋白CAP10的另一區(qū)段表達的重組蛋白CAP10-2不反應，與其它蛋白也無交叉反應。實驗表明，制備的上述單克隆抗體是針對莢膜相關蛋白CAP10的特異性單抗。抗-CAP10單抗的成功制備為臨床新型隱球菌的檢測和血清型的分析奠定了基礎。
　　 2.新型隱球菌檢測方

6、法的比較及在臨床檢測中的應用：經病原分離培養(yǎng)后，以墨汁染色方法檢測陽性的病例作為診斷標準，采用膠體金和乳膠凝集方法對40例腦膜炎腦脊液標本進行檢測，分別比較兩血清學方法檢測新型隱球菌的敏感度和特異性。與墨汁染色方法比較，膠體金和乳膠凝集方法檢測腦膜炎腦脊液標本原液時，其特異性分別為58.3％(14/24)和66.7%(16/24)。都存在一定假陽性，假陽性率分別為41.7%(10/24)和33.3%(8/24)。將臨床標本進行20倍稀釋

7、后進行檢測以降低假陽性率。檢測結果表明，與墨汁染色方法比較，膠體金方法和乳膠凝集方法敏感性達到87.5%(14/16)，特異性為95.8%(23/24)，兩種方法的特異性顯著提高。在經臨床和實驗診斷確診的14例結核性腦膜炎標本進行檢測中發(fā)現(xiàn)，標本為原液時，用膠體金試劑檢測呈現(xiàn)出6例陽性，其中4例乳膠凝集方法檢測結果陽性，假陽性率高。采用標本稀釋后進行檢測則消除了假陽性。結果表明，乳膠凝集和膠體金檢測方法可有效應用于臨床結核性腦膜炎的鑒別