棉花BAC-FISH體系的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、細(xì)菌人工染色體-熒光原位雜交(BAC-FISH)是近年來新興的一門細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)。借助于BAC-FISH技術(shù)，以染色體特異的BAC探針標(biāo)記特定染色體，以適宜的時(shí)期的分裂相(有絲分裂中期或減數(shù)分裂粗線期)進(jìn)行核型分析，有望解決以往棉屬染色體核型分析的種種困難，進(jìn)一步確定與連鎖群對應(yīng)的棉屬染色體物理序號。這對棉花育種研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下： 1.為獲得染色體特異的BAC探針，本研究構(gòu)建了基于菌液P

2、CR和二維交叉實(shí)驗(yàn)的BAC文庫篩選體系。從BAC文庫的3456個(gè)克隆中，共篩選出12個(gè)陽性克隆，涉及13條染色體，9個(gè)SSR標(biāo)記。 2.成功構(gòu)建了BAC-FISH技術(shù)體系，探討了BAC-FISH技術(shù)的關(guān)鍵步驟，包括BACDNA探針的純度和濃度；探針的標(biāo)記方法和標(biāo)記時(shí)間；探針和染色體DNA雜交時(shí)，靶DNA的變性條件；BACDNA中重復(fù)序列的封阻方法和封阻條件等。 3.篩選出含有近著絲粒的SSR標(biāo)記的BAC克隆，獲得了兩個(gè)棉

3、花著絲粒相關(guān)探針：BAC克隆150D24和BAC克隆160C3。前者四倍體和二倍體BAC-FISH圖像顯示，該探針系D(亞)組著絲粒探針，但在A(亞)組著絲粒處無明顯信號；后者在四倍體A亞組著絲粒處信號較強(qiáng)，在D亞組著絲粒處有微弱信號。 4.篩選出含有近端部的SSR標(biāo)記的BAC克隆，獲得了一個(gè)棉花端粒相關(guān)探針：BAC克隆148C1。該探針在四倍體A亞組染色體上雜交信號較強(qiáng)且覆蓋了染色體的末端，在四倍體D亞組染色體部分染色體上僅末

4、端有雜交信號；該探針與二倍體A組染色體的BAC-FISH圖像顯示，染色體末端的雜交信號明顯強(qiáng)于中部。 5.已篩選的其它陽性單克隆的BAC-FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在未封阻的情況下，棉花BAC-FISH獲得特異信號的兩種情況：一是BAC探針來源D亞組染色體；二是BAC探針來源染色體高度重組區(qū)即染色體端部。個(gè)別BAC探針的雜交結(jié)果還顯示出其含有的重復(fù)序列有些是基因組特異的，等等。 6.四倍體中期染色體BAC-FISH圖像的核型