褪黑素對牙髓炎TLR4、NF-κB調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)研究.pdf

1、牙髓炎引起的機(jī)體免疫防御反應(yīng)主要是通過齲病相關(guān)的細(xì)菌等微生物及其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致的，并且一般是通過牙本質(zhì)小管感染牙髓組織引起的。牙髓炎的免疫反應(yīng)有多種免疫細(xì)胞參與，其中樹突狀細(xì)胞在牙髓組織的天然免疫反應(yīng)中的作用最為重要。但是近年來的研究表明牙髓成纖維細(xì)胞在牙髓炎的發(fā)生發(fā)展過程中作用明顯，尤其牙髓成纖維細(xì)胞中表達(dá)的Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）2、3、4以及5在炎癥信號通路方面的調(diào)節(jié)作用等被國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注

2、。
　　TLRs是細(xì)胞膜表面最常見的一類受體蛋白分子，它可以發(fā)現(xiàn)入侵的外源性病源分子包括病原相關(guān)分子模式(pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPs)和危險相關(guān)分子模式(damage Associated Molecular Patterns,DAMPs)，啟動和調(diào)控炎癥發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的愈合過程。其中 TLR4分子是識別內(nèi)毒素，參與炎癥發(fā)生發(fā)展的重要受體分子。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在LP

3、S刺激人牙髓成纖維細(xì)胞后，TLR4、MyD88、NF-κ B信號通路對NLRP3和IL-1β兩種基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，但是其具體機(jī)制尚不明了。
　　隨著人們生活節(jié)奏的加快、壓力增加，由睡眠障礙導(dǎo)致各種炎性相關(guān)疾病發(fā)生率增加，褪黑素(melatonin，MT)具有促進(jìn)睡眠、調(diào)節(jié)免疫等重要功能，可以降低巨噬細(xì)胞以及其他的免疫細(xì)胞中 TLR4、NF-κ B的信號通路的表達(dá)，但是褪黑素對牙髓炎調(diào)節(jié)免疫作用及相關(guān)機(jī)制尚無相關(guān)報道。
　

4、　本實驗通過建立體內(nèi)外牙髓炎癥模型，并施加褪黑素藥物干預(yù)研究 TLR4、NF-κ B信號通路的變化，闡明褪黑素、TLR4、NF-κ B信號通路與牙髓組織固有免疫的關(guān)系，為尋找牙髓炎癥新的治療方法奠定基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容：
　　1.大鼠牙髓炎模型的建立以及相關(guān)炎性因子IL-1β、TNF-α、褪黑素和TLR4、NF-κB的信號通路激活在牙髓炎發(fā)生過程中的作用
　　2.褪黑素對牙髓炎相關(guān)炎性因子IL-1β、TNF-α和TLR

5、4、NF-κB的信號通路調(diào)節(jié)機(jī)制
　　3.褪黑素受體在人牙髓成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及與在牙髓炎中的作用
　　方法：
　　1.大鼠磨牙開髓法建立大鼠牙髓炎模型，HE染色確定牙髓炎的狀況，RT-PCR檢測牙髓中TLR4、NF-κB相關(guān)基因的表達(dá)水平，免疫組化觀察TLR4、NF-κB在牙髓中的表達(dá)情況，ELISA檢測血清中 IL-1β、IL-18、TNF-α、褪黑素濃度以及牙髓中IL-1β和TNF-α的濃度。
　　2.構(gòu)建

6、大鼠牙髓炎模型，通過腹腔注射褪黑素施加藥物干預(yù)措施后，ELISA檢測牙髓中IL-1β和TNF-α的濃度，RT-PCR和免疫組化檢測牙髓中TLR4、NF-κB相關(guān)基因的表達(dá)水平。體外構(gòu)建人牙髓細(xì)胞牙髓炎模型，施加褪黑素干預(yù)后，RT-PCR檢測TLR4、NF-κ B、IL-1β及TNF-α mRNA表達(dá)水平，western-blot檢測TLR4、NF-κ B蛋白表達(dá)水平，ELISA檢測細(xì)胞中IL-1β及TNF-α的濃度。
　　3.應(yīng)用

7、RT-PCR和免疫組化檢測人牙髓細(xì)胞中褪黑素受體的表達(dá)，通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)特異性的減低褪黑素受體的表達(dá)，LPS刺激人牙髓細(xì)胞，再施加褪黑素干預(yù)后，RT-PCR檢測TLR4、NF-κB、IL-1β及TNF-αmRNA表達(dá)水平，western-blot檢測TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平，ELISA檢測細(xì)胞中IL-1β及TNF-α的濃度。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立大鼠牙髓炎模型，牙髓炎后血清中 IL-1β、IL-1

8、8、TNF-α表達(dá)水平升高及牙髓組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平升高，血清中褪黑素含量先降低后升高；免疫組化結(jié)果顯示TLR4、NF-κB在炎癥部位表達(dá)量升高；牙髓組織中TLR4、NF-κB蛋白mRNA表達(dá)水平升高。
　　2.與單純牙髓炎組相比，腹腔注射褪黑素后牙髓炎牙髓組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯下降；TLR4、NF-κB在炎癥部位表達(dá)量明顯下降；牙髓組織中 TLR4、NF-κB蛋白mRNA表達(dá)水平明顯下降。與單純

9、LPS刺激牙髓炎組比較，LPS刺激人牙髓細(xì)胞再施加褪黑素干預(yù)后牙髓細(xì)胞中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯下降；TLR4、NF-κ B在細(xì)胞中表達(dá)量明顯下降；牙髓細(xì)胞中TLR4、NF-κ B、IL-1β、TNF-α蛋白mRNA表達(dá)水平顯著下降。
　　3.人牙髓細(xì)胞中MT1表達(dá)陽性，MT2幾乎無法檢測到，MT1被特異性的干擾后，褪黑素對于牙髓炎的抑制作用明顯減低，與MT1表達(dá)水平正常的牙髓炎組比較，LPS+褪黑素+MT1表達(dá)抑制組的

10、人牙髓細(xì)胞中 IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯上升；TLR4、NF-κB在細(xì)胞中表達(dá)量明顯上調(diào)；牙髓細(xì)胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠牙髓炎后血清IL-1β、TNF-α、IL-18及牙髓組織中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌都明顯升高但血清褪黑素含量下降。
　　2.褪黑素可以抑制大鼠牙髓炎過程牙髓組織中 TLR4、NF-κB、I