過表達(dá)VEGF165和TGFβ1對(duì)人根尖乳頭細(xì)胞礦化及牙本質(zhì)樣組織再生的作用研究.pdf

1、目的:
　　 人根尖乳頭細(xì)胞具有礦化潛能，它在年輕恒牙牙根的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。基于基因轉(zhuǎn)染條件下該細(xì)胞的體外礦化能力的改變及體內(nèi)牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的形成情況少有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究構(gòu)建人血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1hisA-VEGF165;探討人根尖乳頭細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1hisA-VEGF165和pcDNA3.1hisA-TGFβ1后其

2、礦化相關(guān)因子的表達(dá);研究pcDNA3.1hisA-VEGF165和pcDNA3.1hisA-TGFβ1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)后持續(xù)分泌的VEGF165和TGFβ1蛋白對(duì)體內(nèi)牙本質(zhì)樣組織形成的影響。
　　 方法:
　　 提取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)擴(kuò)增VEGF165基因，插

3、入pcDNA3.1hisA，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1hisA-VEGF165，經(jīng)酶切及測序驗(yàn)證正確后，將其和pcDNA3.1hisA-TGFβ1轉(zhuǎn)染人根尖乳頭細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)檢測轉(zhuǎn)染效率和骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)、牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentinsialophosphoprotein，DSPP）、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentinmat

4、rixprotein1，DMP1)的表達(dá)。脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1hisA-VEGF165和pcDNA3.1hisA-TGFβ1轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞中VEGF165和TGFβ1mRNA的表達(dá)，ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后上清中VEGF和TGFβ1蛋白的表達(dá)水平，接種轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞至膠原膜，選擇24只wistar大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙為實(shí)驗(yàn)牙，將各組接種有細(xì)胞的膠原膜置于人工穿髓孔處

5、，ChemFlex充填窩洞。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為以下幾組:(1)直接ChemFlex充填;(2)含正常CHO細(xì)胞的膠原膜+ChemFlex充填;(3)含轉(zhuǎn)染pcDNA3.1hisA細(xì)胞的膠原膜+ChemFlex充填;(4)含轉(zhuǎn)染pcDNA3.1hisA-VEGF165細(xì)胞的膠原膜+ChemFlex充填;(5)含轉(zhuǎn)染pcDNA3.1hisA-TGFβ1細(xì)胞的膠原膜+ChemFlex充填;(6)含轉(zhuǎn)染pcDNA3.1hisA-VEGF165細(xì)胞和p

6、cDNA3.1hisA-TGFβ1細(xì)胞的膠原膜+ChemFlex充填。8周后處死動(dòng)物，分離實(shí)驗(yàn)牙，10％中性福爾馬林溶液固定6d，流水沖洗24h，逐級(jí)用70、90、95和100％酒精脫水，氯仿透明96h，浸泡液浸泡，樹脂包埋，制備硬組織切片，甲苯胺藍(lán)染色。采用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 插入表達(dá)載體的VEGF165基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中

7、的序列具有100％同源性。體外成功分離培養(yǎng)人根尖乳頭細(xì)胞，細(xì)胞呈長梭形。轉(zhuǎn)染VEGF165和TGFβ1的根尖乳頭細(xì)胞其VEGF165和TGFβ1mRNA水平顯著升高;各實(shí)驗(yàn)組DSPPmRNA的表達(dá)均升高(p＜0.05)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1hisA-TGFβ1和共轉(zhuǎn)染組的OCNmRNA升高(p＜0.05)，BSPmRNA無明顯差異(p＞0.05)，DMP1mRNA均降為0。RT-PCR和ELISA結(jié)果顯示CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染后VEGF65和T

8、GFβ1基因和蛋白穩(wěn)定表達(dá)。甲苯胺藍(lán)染色顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1hisA-VEGF165的CHO組中穿髓孔下方見毛細(xì)血管明顯充血及炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，未見硬組織形成;轉(zhuǎn)染pcDNA3.1hisA-TGFβ1的CHO組中穿髓孔下方可見少量深染礦化團(tuán)塊，周圍見增生的牙髓成纖維細(xì)胞，偶見炎癥細(xì)胞浸潤，未見管狀牙本質(zhì)形成;轉(zhuǎn)染pcDNA3.1hisA-VEGF165和pcDNA3.1hisA-TGFβ1的兩種CHO組中穿髓孔下方可見大量深染礦化團(tuán)