不同類型佐劑對(duì)BALB-c小鼠免疫系統(tǒng)作用的研究.pdf

1、2006年英國(guó)發(fā)生的TGN1412I期臨床嚴(yán)重不良反應(yīng)事件表明,對(duì)于作用于免疫系統(tǒng)的藥物,急需建立完善的臨床前免疫毒性評(píng)價(jià)檢測(cè)方法及動(dòng)物模型,尋找靈敏可靠的免疫毒性生物標(biāo)志物,以期準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)臨床不良反應(yīng)。
　　由于目前除細(xì)胞因子外,臨床上尚未有作用明確的小分子免疫增強(qiáng)藥物,而佐劑是能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)的物質(zhì)。因此我們選擇幾種佐劑作為免疫增強(qiáng)劑,使用基因芯片技術(shù)研究佐劑對(duì)免疫系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)譜的影響,從基因水平上尋找與免疫增強(qiáng)相關(guān)的

2、差異表達(dá)基因生物標(biāo)志物;同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)免疫毒性評(píng)價(jià)技術(shù)從免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子、整體免疫功能等各個(gè)水平對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)進(jìn)行全面評(píng)價(jià);通過(guò)體外模型進(jìn)行對(duì)比和驗(yàn)證性研究,進(jìn)一步研究和闡明不同佐劑的作用機(jī)理,為疫苗研發(fā)中佐劑的合理選擇提供參考。
　　1.研究方法:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):8-10周齡的雌性BALB/c小鼠分別肌肉注射PBS、鋁佐劑(10mg/kg)、不同劑量的PolyI:C(0.25,2.5,10mg/kg)和CpG-O

3、DN(0.1,1,5mg/kg),分別于給藥后1h,3h,6h,24h,72h取血解剖,稱量免疫器官重量,對(duì)免疫器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查;T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)(Tcelldependentantibodyresponse,TDAR)檢測(cè),綜合評(píng)價(jià)機(jī)體整體免疫功能;取脾臟使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表型分析,使用Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子含量,使用基因芯片技術(shù)研究小鼠脾臟基因表達(dá)譜的變化情況。
　　體外實(shí)驗(yàn):8-10周齡的

4、雌性BALB/c小鼠,無(wú)菌分離脾臟,制備脾細(xì)胞懸液,用細(xì)胞培養(yǎng)基,鋁佐劑(0.04mg/ml),不同濃度的PolyI:C(0.05,0.25mg/ml)和CpG-ODN(0.005,0.025mg/ml)分別刺激小鼠原代脾細(xì)胞,各佐劑刺激1h,3h,6h,12h,24h,72h后檢測(cè)細(xì)胞存活率。給藥刺激6h后提取細(xì)胞RNA,使用基因芯片技術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞全基因表達(dá)譜的變化。
　　2.研究結(jié)果:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):給藥后72h,Pol

5、yI:C和CpG-ODN使脾臟重量增加。給藥后24hPolyI:C與CpG-ODN脾臟白髓易染體巨噬細(xì)胞數(shù)目增多以及副皮質(zhì)區(qū)易染體巨噬細(xì)胞數(shù)目增多。TDAR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),PolyI:C和CpG-ODN均能提高小鼠抗KLH特異性IgG的抗體滴度。給藥后6h,PolyI:C和CpG-ODN增加脾臟CD69、CD86陽(yáng)性細(xì)胞比例;三種佐劑均升高血漿中促炎細(xì)胞因子和趨化因子水平;PolyI:C上調(diào)干擾素相關(guān)基因,MHCI類基因,促進(jìn)以MHCI類

6、途徑加工和提呈抗原,誘發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用以及Th1型免疫應(yīng)答。CpG-ODN在較高劑量下上調(diào)干擾素相關(guān)基因,啟動(dòng)細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路以及B細(xì)胞受體信號(hào)通路,促進(jìn)T、B細(xì)胞增殖。鋁佐劑對(duì)脾臟幾乎無(wú)免疫刺激作用。
　　體外實(shí)驗(yàn):CpG-ODN在給藥后期能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖?；蛐酒瑱z測(cè)結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)具有較好的一致性,PolyI:C顯著上調(diào)干擾素相關(guān)基因,MHCI類基因,促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。CpG-ODN在較高劑量下上調(diào)干擾素相關(guān)基

7、因,促進(jìn)B細(xì)胞的活化,T細(xì)胞的增殖。鋁佐劑引起的差異基因與佐劑的相關(guān)性不強(qiáng)。
　　3.結(jié)論:CpG-ODN、PolyI:C和鋁佐劑均有明顯的免疫增強(qiáng)作用,小鼠脾臟全基因表達(dá)譜的變化與TDAR檢測(cè)、細(xì)胞因子檢測(cè)、免疫細(xì)胞亞群分析、組織病理學(xué)檢查結(jié)果等具有較好的一致性,其中PolyI:C和CpG-ODN比鋁佐劑能更好的激活機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)。體外直接刺激脾細(xì)胞引起的基因變化與體內(nèi)刺激引起的基因變化具有較高的一致性。本研究為基因芯片技術(shù)