小窩蛋白-1對A549細(xì)胞磷酸膽堿二胞苷酰轉(zhuǎn)移酶的影響及作用機(jī)制初探.pdf

1、目的:觀察小窩蛋白-1(caveolin-1)對A549細(xì)胞磷酸膽堿二胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(CTP)表達(dá)的影響;探討核因子κB（NF-κB）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在磷酸膽堿二胞苷酰轉(zhuǎn)移酶合成中的作用，為臨床有關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病的研究提供依據(jù)和參考。
　　方法:以研究肺表面活性物質(zhì)常用的A549細(xì)胞作為研究對象，運(yùn)用小分子RNA干擾(siRNA)的方法構(gòu)建小窩蛋白-1低表達(dá)模型;并用蛋白印跡法(western blot)檢測小窩蛋白-1的表達(dá)變化;實(shí)驗(yàn)分

2、組如下:①按量效關(guān)系分組:siRNAN濃度為1.0μmol/l、3.0μmol/l、5.0μmol/l;②按轉(zhuǎn)染時(shí)間分組:0h組、24h組、48h組、72h組;③選取5.0μ mol/l的siRNA，轉(zhuǎn)染時(shí)間為72h分組:為轉(zhuǎn)染試劑組，siRNA處理組，錯(cuò)義鏈RNA組;④按小窩蛋白-1對磷酸膽堿二胞苷酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)影響分組:轉(zhuǎn)染試劑組（正常對照組），siRNA處理組（實(shí)驗(yàn)處理組），錯(cuò)義鏈RNA組（陰性對照組）;⑤NF-κB表達(dá)分組:轉(zhuǎn)染試

3、劑組，siRNA處理組，錯(cuò)義鏈組;其他實(shí)驗(yàn)條件均相同。之后對其進(jìn)行總蛋白的提取，隨后蛋白印跡法檢測磷酸膽堿二胞苷酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá);最后對核蛋白進(jìn)行提取并檢測核蛋白P65的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.濃度分別為1.0μmol/l，3.0μmol/l，5.0μmol/l的siRNA孵育細(xì)胞后，5.0μmol/l的siRNA與1.0μmol/l的siRNA條帶相比小窩蛋白-1的表達(dá)降低。
　　2.于0h，24h，48h，72h

4、分別孵育細(xì)胞后，72h組與0h組相比小窩蛋白-1的表達(dá)降低。
　　3.5μmol/l siRNA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞72h，小窩蛋白-1表達(dá)下降，轉(zhuǎn)染組與錯(cuò)義鏈組相比，小窩蛋白-1的表達(dá)降低。
　　4.蛋白印跡法檢測磷酸膽堿二胞苷酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下降;轉(zhuǎn)染組相對錯(cuò)義鏈組小窩蛋白-1的表達(dá)明顯降低。
　　5.提取A549細(xì)胞核蛋白后蛋白印跡檢測胞核蛋白p65，胞核蛋白p65表達(dá)下降。轉(zhuǎn)染組相對錯(cuò)義鏈組p65表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)