人牙周膜成纖維細(xì)胞中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)及尼古丁對(duì)其表達(dá)的影響.pdf

1、吸煙損傷牙周組織，是慢性牙周炎的主要危險(xiǎn)因素。吸煙人群牙周炎的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非吸煙人群，并且在牙周炎患者中，吸煙人群的牙周組織破壞更加明顯。尼古丁作為煙草中的主要生物堿，除可直接損傷牙周組織外，還可通過影響牙周組織免疫系統(tǒng)的正常功能加速其損傷，但確切作用機(jī)制尚未明了。
　　研究發(fā)現(xiàn)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)在尼古丁損傷機(jī)體過程中發(fā)揮重要作用。為觀察人牙周膜成纖維細(xì)胞(Perio

2、dontal ligament fibroblast，PDLF)中ChAT的表達(dá)，并探討在尼古丁對(duì)人PDLF中ChAT損傷過程中的作用，本研究通過建立尼古丁作用下人PDLF體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎肦T-PCR，DNA測序和免疫組化等方法，觀察人PDLF中是否存在ChAT及在尼古丁作用下其表達(dá)的改變。旨在探討ChAT在吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找新的牙周炎防治途徑提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1．人牙周膜成纖維細(xì)胞中ChAT的表達(dá)

3、
　　取12-18歲志愿者正畸減數(shù)拔除的健康第一前磨牙，刮取根中1/3處牙周膜組織，改良組織塊法原代培養(yǎng)PDLF，鑒定，傳代，4-6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用免疫熒光及RT-PCR方法檢測人PDLF中ChAT的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示人PDLF胞漿中存在ChAT的陽性表達(dá)；RT-PCR結(jié)果顯示在與陽性對(duì)照組相同位置299bp處可見陽性條帶，且經(jīng)克隆測序證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物為ChAT。初步證實(shí)，在人PDLF中存在ChAT蛋白及mRNA表達(dá)。

4、　　2．尼古丁對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞中ChAT表達(dá)的影響
　　第4代人PDLF隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組：5％新生牛血清DMEM培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組：尼古丁硫酸鹽(10-12mol/L)溶于含5％新生牛血清DMEM培養(yǎng)液。37℃、5％CO2孵箱中孵育24h。RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR及免疫熒光方法檢測尼古丁對(duì)人PDLF中ChAT表達(dá)的影響。
　　免疫熒光結(jié)果顯示，正常及尼古丁作用下人PDLF存在ChAT陽性表達(dá)，表達(dá)主要位于胞漿。與對(duì)照

5、組相比，尼古丁作用24h后，實(shí)驗(yàn)組人PDLF中ChAT陽性信號(hào)增強(qiáng)。RT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，尼古丁作用24h后人PDLF中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ChATmRNA陽性表達(dá)增強(qiáng)；經(jīng)quantityone分析，表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果。
　　以上結(jié)果證實(shí)，人PDLF中存在ChAT蛋白、mRNA表達(dá)；尼古丁可明顯上調(diào)其表達(dá)。由此推測ChAT可能為尼古丁在牙周組織的作用靶點(diǎn)，在吸煙相關(guān)性牙