SMP30、CNN2與GP73三種HCC相關(guān)抗原對(duì)肝細(xì)胞性肝癌診斷價(jià)值的研究.pdf

1、研究背景：肝細(xì)胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和乙型肝炎在我國(guó)有很高的發(fā)病率和死亡率，廣西是這兩種疾病的高發(fā)區(qū)。目前對(duì)肝癌的診斷手段主要有臨床檢查、影像、病理檢查，但由于肝癌早期臨床癥狀體征不明顯，一旦發(fā)現(xiàn)多為晚期。因此，尋找肝癌早期血清檢測(cè)標(biāo)記物并進(jìn)行簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)是本課題研究的重點(diǎn)內(nèi)容。目前檢測(cè)HCC的血清標(biāo)記物主要是甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP），但是其靈敏度并不能讓人滿

2、意。目前有大量報(bào)道稱幾種指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)疾病的檢出率有明顯提高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，抗衰老標(biāo)記蛋白-30(senescence marker protein-30，SMP30）抗體和抗中性調(diào)寧蛋白（H2-calponin，CNN2）抗體主要見于HCC病人，但是對(duì)HCC患者血清中SMP30、C NN2蛋白水平的檢測(cè)目前沒有報(bào)道。同時(shí)已有大量報(bào)道稱高爾基體糖蛋白（ Golgi protein-73，GP73）對(duì)肝癌的檢出率比較高且與AFP

3、有很好的互補(bǔ)性。
　　研究目的：探討血清SMP30、CNN2、GP73蛋白含量對(duì)HCC的診斷價(jià)值及分析三種蛋白和AFP聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC診斷的臨床意義，為HCC診斷提供更好的選擇。研究方法：利用本課題組構(gòu)建并保存于-80℃的基因工程菌BL21-pET30a-SMP30、BL21-pColdⅢ-CNN2表達(dá)純化得到高純度的SMP30蛋白和CNN2蛋白，并以此作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，分別建立雙抗體夾心ELISA，同時(shí)購(gòu)買GP73檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)原

4、發(fā)性肝癌患者、慢性乙肝患者、慢性乙肝攜帶者、肝硬化患者及正常人血清中SMP30、CNN2、GP73蛋白含量。
　　研究結(jié)果：1.表達(dá)純化的SMP30濃度為0.6mg/mL,純度為92.82％，雙抗體夾心ELISA包被抗體（兔抗人SMP30多克隆抗體）、檢測(cè)抗體一抗（鼠抗人SMP30單克隆抗體）以及酶標(biāo)二抗（羊抗鼠lg G-HRP）的最佳工作稀釋比例分別為1∶200,1∶400,1∶5000,血清最佳稀釋比例為1：5，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸

5、方程為:y=1.673x+0.025,R2=0.996，P<0.001,標(biāo)準(zhǔn)蛋白在3.6～500ng/mL之間有很好的的劑量效應(yīng)關(guān)系。批內(nèi)和指間變異系數(shù)分別為8%和12%。HCC組、肝炎組、健康組的陽性率分別為8.4%（21/250）、0.6%（1/170）、1.4%（3/217)，HCC陽性率高于肝炎組（P<0.001）和健康組（P=0.001），尚不能認(rèn)為肝炎組和健康組的陽性率有差別（P=0.795）。HCC組血清標(biāo)本SMP30蛋白

6、含量明顯高于正常對(duì)照組( P=0.002)和肝炎組（ P=0.001),正常對(duì)照組與肝炎組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.503)。該方法的敏感度為8.4%,特異度為98.86%。血清中SMP30蛋白含量與HCC患者的年齡、AFP含量、肝功能、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤病理等臨床指標(biāo)無顯著性相關(guān)。
　　2.雙抗體夾心ELISA包被抗體（羊抗人CNN2多克隆抗體）、檢測(cè)抗體一抗（兔抗人CNN2多克隆抗體）以及酶標(biāo)二抗（羊抗兔lg G-HRP

7、）的最佳工作稀釋比例分別為1∶200,1∶2000,1∶5000,血清最佳稀釋比例為1：10。檢測(cè)結(jié)果，HCC組、健康組和肝炎組的陽性率分別為2.1%（3/143)、2.8%(6/217)和2.4%(4/170)。三組的CNN2蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該方法的敏感度為2.4%,特異度為97.2%。血清中CNN2蛋白含量與臨床指標(biāo)之間尚不能確定有關(guān)。
　　3.血清GP73蛋白水平在HCC、肝硬化、慢性乙肝、慢性乙肝攜帶者、健康人分

8、別為88.09±64.13、184.20±88.70、149.53±89.76、39.32±8.99和25.27±12.221(ng/mL)。健康組中，血清GP73蛋白水平在不同性別中沒有差別（P=0.819）；HCC組中，男患者血清GP73蛋白水平高于女患者（P=0.001），有肝硬化的患者高于無肝硬化的患者（P=0.002），腫瘤直徑>3cm的患者高于腫瘤直徑≤3cm的患者（P=0.020)。GP73診斷HCC的臨界值為61.93n

9、g/mL，特異度為98.56%，靈敏度為56.93%。
　　4.多個(gè)HCC相關(guān)抗原同時(shí)檢測(cè)可以顯著提高HCC的檢出率。聯(lián)合檢測(cè)價(jià)值最高的組合為AFP+GP73,陽性率為82.35%。
　　結(jié)論：1.成功建立了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)人血清SMP30蛋白，所建立的ELISA方法，批內(nèi)批間差異和穩(wěn)定性均滿足實(shí)驗(yàn)要求。HCC血清SMP30檢出率大于健康組和肝炎組，提示SMP30有望成為一種新的肝癌血清標(biāo)志物。
　　2.HCC